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那么在細胞凍存和復蘇實際操作過程中應(yīng)注意哪些事項呢？

1、凍存和復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。

2、DMSO應(yīng)過濾除菌，甘油用高壓消毒。

3、細胞懸液分裝凍存時要迅速，均勻。安瓿封口后先放入0.05‰美藍溶液中，使冷凍保護劑分布均衡，且可檢出有滲漏的壞安瓿。安瓿上貼上標簽，作好記錄，包括細胞的種屬、來源、代數(shù)、凍存日期、數(shù)量、凍存位置、備注等。

4、細胞降溫應(yīng)逐步進行，先以每分鐘降1～3℃的速度降至-30℃，再加速以15～30℃/分鐘降至-150℃，隨即迅速轉(zhuǎn)入液氮。

5、復蘇時，取出后立即放入37℃水浴中，搖動安瓿，使其*恢復懸液狀態(tài)（20～60秒）。打開安瓿，將內(nèi)容物倒入至少10ml*培養(yǎng)基中，100g離心10分鐘。去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液，混勻，培養(yǎng)。

6、吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因為殘留在吸管頭中的營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。

7、開啟、關(guān)閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細胞。

8、換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

9、吹打細胞時，要注意邊角的細胞是否吹打下來。

10、手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開口容器上方操作。

11、每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。

12、注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO等。

13、從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。