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?免疫PCR實驗主要程序及步驟
閱讀：86 發(fā)布時間：2024-10-21PCR（聚合酶鏈式反應）是一種分子生物學技術，現在已經被廣泛運用于臨床和實驗室，用于擴增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細胞內DNA復制的條件，最終完成特定基因的體外復制。
主要程序：
（1） 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復合物；
（2） 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復合物；
（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；
（4） PCR擴增生物素化DNA部分。
實驗步驟：
（1）制備生物素化DNA
將噬粒 BLuescript skt,用生物素標記的M13引物進行PCR擴增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即為生物素化DNA。
（2）免疫PCR模式
1. 試劑
包被緩沖液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗滌液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀釋液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1mg/ml）。
2.操作
（1） 包被
用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃（約15h），用洗滌液洗板3次×5min。
（2） 封閉：
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min,洗板數次。
（3） 抗原抗體反應：
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未結合的抗體分子。
（4） 鏈親合一蛋白A結合反應：
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50min，使得嵌合體-pUC19結合于固相的抗原抗體復合物上，然后洗板15次×10min,再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應。
（5） PCR
實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明膠（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每種0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。