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PCR產(chǎn)物常用的直接純化技術(shù)方法
閱讀：62 發(fā)布時間：2025-2-14PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、 Taq DNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的酶切、雙脫氧PCR測序反應(yīng)等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現(xiàn)使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。PCR擴增完成后需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在條帶單一無其他雜帶的情況下，可以直接對產(chǎn)物進行純化，常見的純化方法有：
一、產(chǎn)物直接純化：
1、硅膠層析柱法
原理：大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜，實際上就是一層玻璃纖維，其表面有大量修飾的硅羥基（Si-OH），硅羥基在溶液中解離后帶負電，然后與帶正電鹽離子、帶負電DNA形成電橋，從而吸附住DNA，使得DNA雙鏈變單鏈，不會被生物大分子溶劑洗脫，但能經(jīng)水溶性緩沖液水化后，被定量回收，從而實現(xiàn)純化分離。
圖1 硅膠層析原理示意圖
2、磁珠法（abs60151）
原理：磁珠是有磁性的能吸附DNA的物質(zhì)，其內(nèi)部核心是鐵離子，在磁場作用下可以吸附在磁體上。在核心外，經(jīng)過羧化，帶有羧基基團，在特定的離子條件下，可以與DNA結(jié)合。結(jié)合后，在外磁場的作用下，磁珠與DNA結(jié)合體移動到磁體周圍，可以很方便去除其他多余的液體，這時，不能與磁珠結(jié)合的所有雜質(zhì)都隨水溶液一并去除。然后，在洗脫條件下，DNA與磁珠分離，溶解在水中，將溶解有DNA的溶液轉(zhuǎn)移，就得到了純化后的DNA樣本。
圖2 磁珠法結(jié)構(gòu)示意圖
3、其他純化方法
①滲透液結(jié)合醇沉純化
原理：利用分子大小不同，小分子的物質(zhì)能夠通過滲透膜溶解到大量的溶液中去，而大分子的物質(zhì)不能通過滲透膜，所以繼續(xù)留存在透析袋中，通過乙醇沉淀最后達到去除小分子物質(zhì)，得到純化的有機大分子的效果。
②直接沉淀純化
原理：DNA分子在高鹽離子醇溶液中會被沉淀出來，而其他物質(zhì)繼續(xù)溶液在溶液中，沉淀出來的DNA分子經(jīng)過離心與溶液成分分開，達到純化的目的。
不同純化方法對比：
二、其它，凝膠回收純化：
如電泳檢測結(jié)果存在非特異性條帶，則需要將目的條帶切出來，再用膠回收試劑盒（abs60098）對凝膠進行回收純化，相較于直接純化，只是多了一步溶膠的過程，相應(yīng)的產(chǎn)物純度提高，回收率則下降。
結(jié)語：
在PCR擴增完成后，反應(yīng)體系中除了DNA片段，還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)會影響后續(xù)克隆測序等實驗，因此對其產(chǎn)物進行純化是必要步驟，不同的純化手段各有自己的優(yōu)缺點，可以根據(jù)自己的需求選擇適合自己的方法。