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人DC細(xì)胞

一、細(xì)胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：原代樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)體系

傳代特性：根據(jù)細(xì)胞特性傳代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

細(xì)胞簡介：樹突狀細(xì)胞  ( Dendritic cells, DC)  是機體功能的專職抗原遞呈細(xì)胞 ，它能高 效地攝取、加工處理和遞呈抗原 ，未成熟DC具有較強的遷移能力 ，成熟DC能有   效激活初始型T細(xì)胞 ，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。

DC的來源有兩條途徑：  ①髓樣干細(xì)胞在GM-CSF的刺激下分化為DC ，稱為髓樣 DC ，也稱DCl ，與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞；包括朗格漢斯細(xì)胞 ，  間 皮  (或真皮)  DCs以及單核細(xì)胞衍生的DCs等 ，②來源于淋巴樣干細(xì)胞 ，稱為淋 巴樣DC或漿細(xì)胞樣DC ，即DC2 ，與T細(xì)胞和NK細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞。樹突狀 細(xì)胞(DC)表面具有豐富的抗原遞呈分子、共刺激因子和粘附因子 ，是功能強大的 專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)。  DC自身具有免疫刺激能力 ，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能激活 未致敏的初始型T細(xì)胞的APC。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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