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免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理先將已知抗體標(biāo)上英光素以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光從而可確定組織中某種抗原的定位進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。那實(shí)驗(yàn)背景染色較深的原因有哪些?

1、抗體濃度過(guò)高一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見的原因之一。解決辦法是每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書進(jìn)行染色。

2、抗體孵音時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高解決辦法是嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程更好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘及時(shí)提醒避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)而是30分鐘因此要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

3、DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)DAB更好現(xiàn)用現(xiàn)配如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)因?yàn)樵跊]有酶的情況下過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色更好在顯微鏡下監(jiān)控達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

4、組織變干修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈可以有效的避免液體流失也能提高操作速度。

5、切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(大于24小時(shí))原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前將切片脫蠟至修復(fù)第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在40C冰箱過(guò)夜對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響如果放在室溫特別是炎熱的夏天會(huì)出現(xiàn)背景著色因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。

6、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克降抗體注意抗體的有效期過(guò)期的抗體要么不昂色要么背暑著色，用新買抗體時(shí)更好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。