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實(shí)驗(yàn)室微生物細(xì)胞大小測(cè)定介紹

閱讀:155          發(fā)布時(shí)間:2025-3-17

    細(xì)菌群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidityestimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過(guò)濾法(membrane filtration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定,細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA 和DNA 的含量測(cè)定,代謝產(chǎn)物的測(cè)定等。

一、微生物細(xì)胞大小的測(cè)定
1、目鏡測(cè)微尺的校正
把目鏡的上透鏡旋下,將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上,把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上,刻度朝上。先用低倍鏡觀察,對(duì)準(zhǔn)焦距,視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后,轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡,使目鏡測(cè)微盡與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行,移動(dòng)推動(dòng)器,使兩尺重迭,再使兩尺的“0"刻度全重合,定位后,仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)全重合的刻度,計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)10µm,所以由下列公式可以算出目鏡測(cè)微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度。

目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度
例如:目鏡測(cè)微尺5小格正好與鏡臺(tái)測(cè)微尺5小格重迭,已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每小格為10µm
目鏡測(cè)微尺上每小格長(zhǎng)度為。
用同樣方法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。
由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同,因此校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件(特定的物鏡、目鏡、鏡筒長(zhǎng)度)進(jìn)行,而且只能在該顯微鏡上重復(fù)使用,當(dāng)更換不同顯微鏡目鏡或物鏡時(shí),必須重新校正目鏡測(cè)微尺每一格所代表的長(zhǎng)度??潭戎睾?br/>
2、細(xì)胞大小的測(cè)定
⑴將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液(10-2)。
⑵取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。
⑶移去鏡臺(tái)測(cè)微尺,換上酵母菌水浸片,先在低倍鏡下找到目的物,然后在高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺來(lái)測(cè)量酵母菌菌體的長(zhǎng),寬各占幾格,不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)。測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的校正值,即等于該菌的長(zhǎng)和寬。一般測(cè)量菌體的大小要在同一個(gè)標(biāo)本片上測(cè)定10~20個(gè)菌體,求出平均值,才能代表該菌的大小。待測(cè)微生物需用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行測(cè)定。
⑷同樣方法用油鏡測(cè)定枯草桿菌染色標(biāo)本的細(xì)胞大小。

二、微生物細(xì)胞的顯微直接計(jì)數(shù)法
1、視待測(cè)菌懸液濃度,加無(wú)菌水適量稀釋(斜面一般稀釋到10-2),以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。
2、取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊,在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。
3、將酵母菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴,不宜過(guò)多,讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū),勿使氣泡產(chǎn)生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上,注意不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片,勿使產(chǎn)生氣泡。
4、靜置片刻,將血球計(jì)數(shù)板置載物臺(tái)上夾穩(wěn),先在低倍鏡下觀察到計(jì)數(shù)區(qū)后,再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近,觀察時(shí)應(yīng)適當(dāng)關(guān)小孔徑光闌并減弱光照的強(qiáng)度。
5、計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格組成,按對(duì)角線方位,數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū),除數(shù)上述四個(gè)大方格外,還需數(shù)中央1個(gè)大方格的菌數(shù)(即80個(gè)小格)。如菌體位于大方格的雙線上,計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤差。
6、對(duì)于出芽的酵母菌,芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí),即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2~3次,每次數(shù)值不應(yīng)相差過(guò)大,否則應(yīng)重新操作,求出每一個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)(N),按公式計(jì)算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。
7、測(cè)數(shù)完畢,取下蓋玻片,用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干,放入盒內(nèi)保存。

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