Human Coronavirus（HCoV）人科研染料法熒光定量通用RT-PCR試劑盒注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

 

產(chǎn)品名稱	人科研染料法熒光定量通用RT-PCR試劑盒
英文名稱	Human Coronavirus（HCoV）
編號	BJP3158

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到全世界的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。定量PCR除可以對樣品的初始濃度進行準確定量外，還有其它多種豐富的應(yīng)用。還包括基因表達調(diào)控情況的分析、等位基因的分析等。

熒光定量PCR服務(wù)：
人科研染料法熒光定量通用RT-PCR試劑盒簡介：實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
以下產(chǎn)品是公司正在*產(chǎn)品：

頭孢孟多鋰標準品5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽 BCIP  Amresco

頭孢孟多酯鈉標準品L-Norvaline  L-正纈氨酸

頭孢地尼相關(guān)物質(zhì)B標準品L-Norvaline  L-正纈氨酸

頭孢妥侖匹酯標準品L-Norvaline  L-正纈氨酸

頭孢唑林鈉標準品Uracil 尿嘧啶

頭孢地尼標準品O-Acetyl-L-serine hydrochloride O-酰-L-絲氨酸鹽酸鹽

頭孢地尼相關(guān)物質(zhì)A標準品O-Acetyl-L-serine hydrochloride O-酰-L-絲氨酸鹽酸鹽

鹽酸頭孢吡肟標準品鄰菲羅啉 ;1,10-菲羅啉;鄰二氮菲

鹽酸頭孢吡肟系統(tǒng)適應(yīng)性用標準品Esculin sesquihydrate 七葉苷

頭孢克肟標準品D-Glucosamine D-氨基葡萄糖苯海拉明檸檬酸鹽標準品L-Lysine-L-aspartate L-賴氨酸-L-天冬氨酸鹽

鹽酸苯海拉明標準品L-Ornithine L-aspartate salt L-鳥氨酸L-天冬氨酸鹽

地芬諾酯鹽酸鹽標準品N-Acetyl-L-glutamine N-酰-L-谷氨酰胺

鹽酸地匹福林標準品D-Phenylalanine  D-苯氨酸

雙嘧達莫標準品偶氮脒類引發(fā)劑V50

地紅標準品Chlorhexidine digluconate 氯己定二葡糖酸鹽

5'-鳥苷酸二鈉標準品N-Acryloxysuccinimide N-烯酰氧基琥珀酰亞胺

肌苷酸二鈉標準品D-Valine  D-纈氨酸

尿苷酸二鈉標準品D-Threonine D-蘇氨酸

磷酸吡胺標準品L-Aspartic acid Mg salt L-天門冬氨酸鎂