詳細介紹
Avidin-FITC/FITC標(biāo)記親和素
幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素(AV)或鏈霉親合素(SA)結(jié)合。小分子的有125I、膠體金、熒光素和化學(xué)發(fā)光物,大分子物質(zhì)有酶、抗原或抗體、鐵蛋白和熒光蛋白等,其中常用的是酶、異硫氰酸熒光素(FITC)和膠體金. 親和素或鏈霉親和素均為大分子蛋白,其與酶的標(biāo)記結(jié)合物的制備除可用普通酶標(biāo)記蛋質(zhì)分子的直接標(biāo)記法外.由于其*的與生物素結(jié)合的性能,還可以通過與生物素化酶復(fù)合物中的生物素結(jié)合,間接地與酶形成結(jié)合物。
以下舉例介紹幾種制備親和素(或鏈霉親和素)與常用酶形成標(biāo)記結(jié)合物的方法。
(一)親和素的標(biāo)記
1.HRP-親和素結(jié)合物的制備
(1)改良過碘酸鈉法:新配制的HRP溶液中加入過碘酸鈉(NaIO4),將酶分子上的糖基氧化成醛基;依次用醋酸鹽溶液(pH4.5—5)和碳酸鹽緩沖液(pH9.0)透析,然后在HRP醛基溶液中滴加親和素攪拌反應(yīng),HRP的醛基即可與親和素的氨基共價結(jié)合;加入(NaBH4)終止反應(yīng),再透析、離心去沉淀,上清液即含HRP-AV結(jié)合物:
(2)戊二醛法:用新配制的HRP與親和素溶液充分混勻,加雙功能交聯(lián)劑戊二醛室溫反應(yīng),后者的二個醛基分別與HRP和親和素分子中的氨基形成Schiff's,堿使二者連接,經(jīng)充分透析去掉未反應(yīng)戊二醛,再離心去沉淀等雜質(zhì),收集上清液(含HRP-AV結(jié)合物)。
2.親和素-生物素化HRP復(fù)合物的制備:
利用親和素與生物素間特異的結(jié)合,將親和京素與等體積的生物素化酶(HRP-B)按一定濃度比例混合反應(yīng)后,親和素即與HRP-B中的生物素結(jié)合,形成親和素—生物素化HRP復(fù)合物(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)。
制備ABC復(fù)合物時應(yīng)注意,親和素和HRP-B的濃度應(yīng)控制不高于40μg/ml和10μg/ml,否則將增加非特異反應(yīng)。
3.親和素-生物素化堿性磷酸酶(avidin-biotinylated—alkaline phosphatase,ABAP)復(fù)合物的制備:將親和素溶液與生物素化AP按4:l(濃度比)比例混合反應(yīng)(至少十分鐘)后即可制得ABAP復(fù)合物。
(二)鏈霉親和素的標(biāo)記
鏈霉親和索(SA)因表面所帶正電荷少,且不含糖基,在實驗中的非特異性結(jié)合遠低于親和素,因此目前以鏈霉親和素標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用。
1.HRP-SA結(jié)合物的制備
采用過碘酸鈉直接標(biāo)記:反應(yīng)在4℃進行,先在HRP中加入NaIO4,然后直接加鏈霉親和素溶液混勻,再用碳酸鹽緩沖液(PH9.0)透析后,用KBH4終止反應(yīng):加飽和硫酸銨沉淀,離心后棄上清液,再用PBS復(fù)溶沉淀即得HRP-SA結(jié)合物.
2.SA-生物素化HRP復(fù)合物的制備
按BNHS標(biāo)記抗體法制備生物素化HRP( HRP-B),再將HRP-B適當(dāng)稀釋后,加入等體積的鏈霉親和素溶液(HRP-B與SA濃度比約1:4)反應(yīng),即可制得SA-生物素化酶復(fù)合物(streptavidin-biotin-peroxidaes complex,SABC).
3.AP-SA結(jié)合物的制備
采用戊二醛二步法:先用飽和硫酸銨沉淀堿性磷酸酶,離心后加過量戊二醛溶液復(fù)溶堿性磷酸酶沉詫.戊二醛的一個醛基即與堿性磷酸醇的氨基結(jié)合:充分透析除去未結(jié)合戊二醛后,加鏈霉親和素與結(jié)合了堿性磷酸酶的戊二醛另一個醛基結(jié)合,用賴氨酸終止反應(yīng),離心后留取含AP-SA結(jié)合物上清液備用。
Avidin-FITC/FITC標(biāo)記親和素
Streptavidin-CY5
Streptavidin-CY3
Streptavidin-TRITC
Streptavidin-FITC
Streptavidin-thiol
Avidin-CY3
Avidin-CY5
Avidin-CY5.5
Avidin (without modification)
Avidin-Sepharose
Avidin-thiol
Avidin-FITC
Avidin-TRITC
HAS- Sepharose beads
HSA-SH
HSA-Biotin
HSA-TRITC
HSA-FITC
HSA-CY5
HSA-CY3
HSA-CY5.5
HSA, without modification
BSA-Sepharose beads
BSA-SH
BSA-Biotin
BSA-TRITC
BSA-FITC
BSA-CY5
BSA-CY3
BSA-CY5.5
BSA, without modification
BSA-tetramethylrhodamine
Concanavalin A刀豆求蛋白A產(chǎn)品:
Concanavalin A-CY5
Concanavalin A-CY3
Concanavalin A-CY5.5
Concanavalin A-Sepharose
Concanavalin A-Biotin
Concanavalin A-SH
Concanavalin A-tetramethylrhodamine
Concanavalin A-FITC
Concanavalin A (without modification)
Protein A (recombinant)產(chǎn)品:
Recombinant Protein A-CY5
Recombinant Protein A-CY3
Recombinant Protein A-CY5.5
Recombinant Protein A-peroxidase (HRP)
Recombinant Protein A-Agarose Beads
Recombinant Protein A-Biotin
Recombinant Protein A-thiol
Recombinant Protein A-tetramethylrhodamine
Recombinant Protein A-FITC
Recombinant Protein A (without modification)