農(nóng)藥殘留樣品的提取

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上海連橋生物科技有限公司

分析樣品的分類

由于樣品中的物質(zhì)和結(jié)構(gòu)的差異，使得樣品的提取，尤其是濃縮提取的凈化。

一般將樣品分為三類：

1.中等和高含水量的樣品：

根和鱗莖類蔬菜：胡蘿卜、洋蔥；

葉綠素含量zui低的蔬菜和水果：仁果、核果、漿果和柑橘；

葉綠素含量高的作物：葉菜和豆菜。

2.干燥品。

3.油脂類。

農(nóng)藥殘留提取條件的選擇

提取就是將殘留在樣品中的多種農(nóng)藥，采用合適的有機(jī)溶劑和方法，將其分離出來，以供凈化后測定，這是農(nóng)藥分析非常關(guān)鍵的一步。提取效果的好壞，一方面決定于溶劑的選擇，另一方面和提取的方法也有密切的關(guān)系。在選擇提取溶劑時，既要注意到溶劑本身的性質(zhì)，又要結(jié)合農(nóng)藥的特性及樣品的狀況，在選用提取方法時也要考慮上述情況。

1.溶劑的選擇：在農(nóng)藥分析中幾乎不單獨采用非極性溶劑，通常是與極性溶劑混合使用或只采用極性溶劑。

主要溶劑的極性強(qiáng)弱如下：

水>乙腈>甲醇>醋酸>乙醇>乙丙醇>丙酮>二惡烷>四氫呋喃>甲基乙基甲酮>苯酚>正丁醇>乙酸乙酯>yi醚>硝基甲烷>二氯甲烷>氯仿>苯>甲苯>二甲苯>四氯化碳>二硫化碳＞環(huán)己烷>正己烷>正庚烷>煤油

在農(nóng)藥分析中應(yīng)用*的溶劑為石油醚、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯等。

2.農(nóng)藥的極性：在提取樣品中的農(nóng)藥殘留時，農(nóng)藥本身的極性以及在提取溶劑中的溶解度，直接影響提取效果，一般采用和農(nóng)藥極性相仿的提取溶劑，即“相似相溶"原理，選擇具有廣泛覆蓋面的溶劑作為農(nóng)殘?zhí)崛∪軇?。部分有機(jī)磷的極性強(qiáng)弱如下：

氧huale果>敵baichong>didi畏>馬拉流磷>beishu磷>甲基duiliu磷>對liulin>jiaban磷>溴硫磷>辛liulin

3.樣品的狀況：樣品的特點和狀態(tài)，在提取時也必須認(rèn)真考慮。在AOAC 中將樣品分為脂肪性和非脂肪性兩大類。脂肪含量大于10%為脂肪樣品，小于則為非脂肪性樣品。脂肪性大的樣品，需要先提取脂肪，而后測定脂肪中的農(nóng)藥殘留量。

非脂肪性的樣品又分為含水樣品和干品兩大類；前者的水分含量≥75%，后者為干的或低水分樣品。含水分樣品又分含糖多少分類：含糖5%以下，含糖15~30%等幾種。

不同現(xiàn)狀的樣品,必須采用不同的提取溶劑。在谷物、茶葉一類水分低的樣品中，不同提取溶劑的提取效率的差異最為突出，即便采樣極性溶劑也不能*提取，必須采用含水20~40%的溶劑或預(yù)先向試樣中加入等量的水之后再行提取。土壤是個比較特殊的樣品，是農(nóng)藥污染最大的受害者，許多農(nóng)藥較強(qiáng)的與土壤耦合，比動植物組織的提取更困難。土壤的水分、有機(jī)質(zhì)、極性化合物以及其他因素的不同對農(nóng)藥的結(jié)合也不同，一般粘土高沙土低。

農(nóng)藥殘留的提取和純化(凈化)

在農(nóng)藥殘留分析中，提取溶劑必須適用于具有不同含量的水分、油脂、糖分和物質(zhì)的基質(zhì)中，提取出具有各種極性的化合物。為了提供合適的條件，使殘留物從樣品中轉(zhuǎn)移到提取溶液中。例如土壤、糧食等干燥樣品一種或多種混合溶劑浸泡，經(jīng)震蕩或索氏提??；中、高含水量的樣品，需在高速搗碎機(jī)中，在一種或混合溶劑的存在下加以粉碎。在通常情況下，蔬菜和水果用勻漿機(jī)或組織搗碎機(jī)提取。

1.初步提取溶劑的體系

(1)丙酮提取法：用于含多糖類樣品中農(nóng)藥的提取，再用二氯甲烷經(jīng)液-液分配轉(zhuǎn)入二氯甲烷中。在有機(jī)磷和有機(jī)氮多殘留分析中已經(jīng)廣泛使用。

(2)乙腈提取法：適用于一些農(nóng)藥，但若是水溶的農(nóng)藥時，采用二氯甲烷進(jìn)行液-液分配。

(3)丙酮-正已烷混劑：用于非極性化合物，極性有機(jī)磷和有機(jī)氮農(nóng)藥及其性代謝產(chǎn)物。此外，也有報道采用乙腈-二氯甲烷、乙腈-氯仿、丙酮-二氯甲烷、丙酮-石油醚。

對于谷物、秸秤、茶、土壤等干燥樣品，添加一倍水量后或用含水溶液提取，提取率比直接用極性溶劑要高得多。

2.初步提取液的純化(凈化)

(1)液-液分配凈化法：液-液分配是一種常用的凈化方法，基本原理是分配規(guī)律，根據(jù)農(nóng)藥與雜質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差別，常用一種非極性溶劑和極性溶劑對來進(jìn)行分配，如：丙酮-已烷、乙腈-乙烷(石油醚)、丙酮-二氯甲烷、二甲基甲酰胺-已烷等。

農(nóng)藥與脂肪、蠟質(zhì)、色素等一起被正已烷提取后，再用一種極性溶劑，如乙腈與共同震搖，使農(nóng)藥與脂肪、蠟質(zhì)、色素*分開。這樣農(nóng)藥大部分被乙腈所提取，經(jīng)幾次提取，農(nóng)藥幾乎可以*與脂肪等雜質(zhì)分離，從而達(dá)到凈化的目的。

(  2 )弗羅里硅土柱層析方法：弗羅里硅土柱層析凈化方法在農(nóng)藥殘留分析中已有廣泛應(yīng)用，而在多殘留分析中常用極性不同的溶劑體系，把各種農(nóng)藥淋洗入不同的洗提餾分中，使農(nóng)藥得到分組分離。

MILLS 等提出的淋洗體系為A、B、C3 種極性依次增大的體系：A液：二氯甲烷：正已烷(1:4) B液：二氯甲烷：乙腈：正已烷(50:0.35：49.65)、C液：二氯甲烷：乙腈：正已烷(50：1.5：48.5)。

THEIR 的用石油醚：二氯甲烷(4:1);石油醚：二氯甲烷(3:3);二氯甲烷：甲醇(19：1)的淋洗體系，分離水果和蔬菜中的一些磷酸酯、有機(jī)氯、甲基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯和脲類農(nóng)藥。

黃士忠等研究采用二氯甲烷：石油醚：丙酮(6:3:1)預(yù)淋及二氯甲烷：石油醚：丙酮(6:3.5:0.5)淋洗，分離了土壤和糧食中10 種有機(jī)氮，回收率81~103%。

農(nóng)藥殘留的提取

盡管農(nóng)藥殘留的種類很多，各種農(nóng)藥殘留的性質(zhì)也不盡相同，但是一些基本的提取方法是一致的。目前，農(nóng)藥殘留的提取方法大致有以下幾種：對于固體或半固體樣品，常采用索氏提取法(Soxhlet extraction，SE)、超聲波提取法(ultrasonic wave extraction，UE)、加速溶劑提取法(accelerated solvent extraction,ASE)、超臨界流體萃取法(supercritical fluid extration，SFE)、微波輔助提取法(microwave—assisted extraction，MAE)和基質(zhì)固相分散法(matrix solid—phasedispersion，MSPD)等；對于液體樣品，提取的方法包括液液萃取法(1iquid-liquid extraction，LLE)、固相萃取法(solid—phase extraction，SPE)和固相微萃取法(solid—phase microextraction，SPME)等，其中SPME也可以處理固體或半固體樣品。

索氏提取法(SE)是一種經(jīng)典萃取方法，它利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被溶劑提取。該法的特點是提取效率高，操作簡便，但提取時間長，需消耗大量的溶劑。在有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的提取中常用SE。

超聲波提取法(UE)是Johnson等于1967年提出的?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為UE的三大理論依據(jù)是空化效應(yīng)(cavitation effect)、熱效應(yīng)(thermal effect)和機(jī)械作用(mechanical effect)。所謂空化效應(yīng)是指存在于液體中的微小氣泡(空化核)在超聲波的作用下振動、生長并聚集聲場能量，當(dāng)能量達(dá)到某個閾值時，空化氣泡急劇崩潰的過程。氣泡崩潰時可釋放出巨大能量，產(chǎn)生速度約為11Om／s、具有強(qiáng)烈沖擊力的微射流，并在崩潰的瞬間產(chǎn)生局部高溫高壓(5000K，1800atm)，從而使非均相物質(zhì)間均勻混合，加速物質(zhì)的擴(kuò)散。熱效應(yīng)是指超聲波在介質(zhì)的傳播過程中，其聲能不斷被介質(zhì)中的質(zhì)點吸收，并轉(zhuǎn)化為熱能的現(xiàn)象。熱能可促進(jìn)介質(zhì)中質(zhì)點的運(yùn)動，增加物質(zhì)的溶解性。機(jī)械效應(yīng)是超聲波在傳播中使質(zhì)點產(chǎn)生振動，從而增強(qiáng)介質(zhì)的擴(kuò)散與傳質(zhì)能力，促成液體乳化、凝膠液化和固體分散的過程?？傊?，超聲波通過加速分子運(yùn)動，從而促進(jìn)樣品中各組分脫附與溶解，提高提取效率。

加速溶劑提取法(ASE)是在高溫(50~200℃)及加壓(102~136atm)條件下的溶劑提取方法。高溫可以加快待分析物從基體中解吸出來而進(jìn)入溶劑中；加壓能使溶劑保持液態(tài)，從而用少量的溶劑就可快速提取固體分析物。該方法的優(yōu)點是有機(jī)溶劑用量少(1g樣品僅需1.5mL溶劑)、快速(一般為15min)、基質(zhì)影響小、回收率高、重現(xiàn)性好，是目前樣品前處理的最佳方式之一。本方法已經(jīng)廣泛用于環(huán)境、藥物、食品和高聚物等樣品的前處理，特別是在有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析中應(yīng)用較多。

超臨界流體萃取法(SFE)是利用超臨界流體具有較高的擴(kuò)散系數(shù)，較低的黏度，與液體密度相似的性質(zhì)，以及在不同壓力的超I臨界流體中被萃取物質(zhì)的化學(xué)親和力和溶解性的差異，通過控制超臨界流體的條件，進(jìn)行組分分離純化的方法。SFE的特點是樣品用量少，樣品提取在低溫下進(jìn)行，避免了分析目標(biāo)物的損失及降解，大大提高了分析方法的可靠性。

微波輔助提取法(MAE)是1986年匈牙利學(xué)者Ganzler等首先發(fā)現(xiàn)的。他們利用微波作為提取過程的輔助手段，成功地萃取了土壤、食品、飼料等固體物中的有機(jī)物。對樣品進(jìn)行微波加熱，利用極性分子可迅速吸收微波能量的特性，加熱一些具有極性的溶劑與樣品，達(dá)到萃取樣品中目標(biāo)化合物的目的。與傳統(tǒng)的振蕩提取法相比，MAE具有高效、安全、快速、試劑用量小和易于自動化控制等優(yōu)點，適用于熱不穩(wěn)定性物質(zhì)如農(nóng)藥等的提取，并可同時進(jìn)行多個樣品的同時提取。

基質(zhì)固相分散法(MSPD)是將試樣直接與適量填料[一般是C18、Al20O3、Florisil(弗羅里硅土)和硅膠等固相萃取填料]研磨、混勻制成半固態(tài)物質(zhì)，然后裝柱、淋洗分離的技術(shù)。MSPD濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理過程中所需要的樣品均化、組織-N~g4、提取、凈化等過程，避免了樣品均化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮等造成的待測物的損失。MSPD自1989年提出之后，已在蔬菜、水果的農(nóng)藥殘留分析中得到廣泛的應(yīng)用。    

液液萃取法(LLE)是利用樣品中一些農(nóng)藥殘留(如有機(jī)氯農(nóng)藥殘留)在互不相溶的兩種溶劑中分配系數(shù)的差異而進(jìn)行分離，從而達(dá)到純化被測物質(zhì)并消除基質(zhì)干擾的方法。

固相萃取法(SPE)足基于液相色譜理論的一種分離、純化方法。它利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾物分離，然后再以洗脫液或加熱的方式解吸附，從而達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。與LLE相比，SPE的優(yōu)點是它不需要大量使用溶劑，處理過程不會發(fā)生乳化現(xiàn)象，同時所需費(fèi)用也有所減少。一般來說，SPE所需的萃取時間為LLE的1／2，而費(fèi)用只為LLE的1／5。其缺點是日標(biāo)化合物的回收率和精密度低于LLE。

固相微萃取法(SPME)是在SPE的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種嶄新的萃取分離技術(shù)。SPME是指在微量進(jìn)樣器的針頭部分涂一層相當(dāng)于GC固定液的物質(zhì)或鍵合一層固定相，然后直接將其插入液體樣品中或樣品的頂空，萃取、濃縮有機(jī)化合物，最后將進(jìn)樣器直接插入GC等進(jìn)樣口加熱，使被測物進(jìn)入檢測器從而進(jìn)行分析測定。目前sPME已經(jīng)廣泛用于食品中殘留農(nóng)藥的提取。

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