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ALPHA 高靈敏度均相檢測技術(shù):藥物研發(fā)的強(qiáng)大工具

2024-11-12  閱讀(145)

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ALPHA(Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay)是一種基于微珠的高靈敏度均相檢測技術(shù)。與 HTRF 技術(shù)類似,ALPHA 技術(shù)適用于藥物發(fā)現(xiàn)階段的高通量篩選,屬于免洗的免疫檢測技術(shù),已在國內(nèi)外藥物研發(fā)企業(yè)和科研院所中獲得廣泛認(rèn)可。本文將簡要介紹 ALPHA 技術(shù)的原理、技術(shù)特點(diǎn)、家族及主要應(yīng)用、多重檢測以及使用注意事項(xiàng)。

一、Alpha 基本原理

Alpha 技術(shù)使用供體和受體兩種微珠。當(dāng)結(jié)合于供體微珠上的分子 A 與結(jié)合于受體微珠上的分子 B 相互作用,且兩個(gè)微珠距離足夠接近(<200nm)時(shí),能夠檢測出發(fā)光信號。供體微珠表面的光敏劑經(jīng) 680nm 的激光照射后被激發(fā),將周圍的氧轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。單線態(tài)氧在溶液中擴(kuò)散,遇到受體微珠后可在受體微珠內(nèi)引發(fā)一系列級聯(lián)放大的化學(xué)反應(yīng),并最終發(fā)射出光。若分子 A 與分子 B 不發(fā)生相互作用,則供體微珠產(chǎn)生的單線態(tài)氧不會(huì)到達(dá)受體微珠,從而不會(huì)引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

二、Alpha 技術(shù)特點(diǎn)

均相檢測:無需洗滌步驟,操作簡便。

較寬檢測范圍:適合 nM 至 μM 范圍的親和力檢測。

低背景、高靈敏度:可避免環(huán)境因素的自發(fā)熒光背景干擾。

更適合生物分子檢測:有效距離可達(dá) 200nm。

更多檢測因子:適合更多的因子檢測。

可用于微量檢測:樣品用量可低至 5 微升。

易于自動(dòng)化檢測:適合 96、384 和 1536 微孔板規(guī)格。

多重檢測:可用于多重因子同時(shí)檢測。

與 ELISA 相比,AlphaLISA 在洗板、實(shí)驗(yàn)步驟、微孔板規(guī)格、自動(dòng)化程度、實(shí)驗(yàn)通量、樣品量、靈敏度、檢測范圍和性價(jià)比等方面具有明顯優(yōu)勢,并且可以進(jìn)行多重檢測。

三、Alpha 家族及主要應(yīng)用

Alpha 微珠類型

Alpha 微珠分為供體微珠(Donor Bead)和受體微珠(Acceptor Bead)。在 Alpha 技術(shù)中,供體微珠相同,經(jīng)激光激發(fā)后可產(chǎn)生單線態(tài)氧分子。受體微珠根據(jù)發(fā)射波長不同分為四種類型:AlphaScreen(紅熒烯,發(fā)射波長 520 - 620nm)、AlphaLISA(銪 Eu,發(fā)射波長 615 - 623nm)、AlphaPlex 545(鋱 Tb,發(fā)射波長 515 - 555nm)和 AlphaPlex 645(釤 Sm,發(fā)射波長 645nm)。

AlphaScreen 和 AlphaLISA

AlphaScreen 是第一代 Alpha 技術(shù),受體微珠發(fā)射波長為連續(xù)的 520 - 620nm 波段。

AlphaLISA 是升級后的技術(shù),受體微珠發(fā)射波長非常窄,峰值在 615nm 附近,可避免很多干擾因素,降低假陽性和假陰性。目前,AlphaLISA 產(chǎn)品已替代 AlphaScreen 的大部分產(chǎn)品。AlphaLISA 技術(shù)主要應(yīng)用于蛋白與蛋白相互作用(PPI)、激酶和表觀遺傳學(xué)研究的生化篩選、第二信使檢測(GPCR)以及生物標(biāo)志物檢測(Cytokine、Biomarker)等領(lǐng)域。在細(xì)胞因子檢測中,AlphaLISA 提供 Biotin-Free 版本的檢測試劑盒,降低細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中生物素對檢測結(jié)果的干擾。AlphaLISA 還提供雙重檢測的試劑盒。

Alpha Surefire 和 Alpha Surefire Ultra

在研究信號通路的磷酸化蛋白檢測中,需使用 Alpha Surefire 系列產(chǎn)品。Alpha Surefire Ultra 版本進(jìn)行了兩個(gè)更新設(shè)計(jì):采用 CaptSure 技術(shù)替代早期版本的 Protein A 鏈接結(jié)構(gòu),提升抗體捕獲的特異性;改用 AlphaLISA 受體微珠,具有更好的光譜特性。目前,AlphaLISA Surefire Ultra 技術(shù)主要用于信號分子的總蛋白和磷酸化蛋白檢測。

四、Alpha 技術(shù)的多重檢測

Alpha 技術(shù)提供三種發(fā)射波長的受體微珠,理論上可同時(shí)進(jìn)行三種分子的檢測,但考慮酶標(biāo)儀配置因素,目前大多數(shù)情況下只能同時(shí)進(jìn)行兩種分子的檢測。

AlphaLISA 的雙重檢測

Alpha 技術(shù)一般采用包被 Eu 的受體微珠,對于部分生物標(biāo)志物的檢測,也提供 Tb 包被的受體微珠檢測試劑盒(AlphaPlex),可在一個(gè)微孔板孔內(nèi)檢測兩種細(xì)胞因子。

Alpha Surefire Ultra 的雙重檢測

針對檢測蛋白的種類不同,分為兩種情況:

同一個(gè)靶點(diǎn)的總蛋白和磷酸化蛋白檢測推薦使用 MPSU 版本(Alpha SureFire Ultra Multiplex),提供套裝試劑盒,可同時(shí)檢測總蛋白及特定磷酸化蛋白的含量變化。

不同靶點(diǎn)的磷酸化蛋白檢測需分別購買兩種 Surefire Ultra 試劑盒,即 Alpha Surefire Ultra kit(ALSU)和 Terbium SureFire Ultra kit(TBSU),可在一個(gè)孔內(nèi)同時(shí)檢測不同蛋白的磷酸化水平。目前,Alpha 提供 30 余種 TBSU 的檢測試劑盒,可與 ALSU 搭配使用。特別提示,TBSU 試劑盒不能單獨(dú)使用。

五、Alpha 技術(shù)使用注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)過程中部分步驟需避光,盡量保持恒溫。

使用時(shí),盡量按照說明書的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

微珠試劑不要冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)前請先確認(rèn)酶標(biāo)儀的功能和配置。



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