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ALPHA（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay）是一種基于微珠的高靈敏度均相檢測(cè)技術(shù)。與 HTRF 技術(shù)類(lèi)似，ALPHA 技術(shù)適用于藥物發(fā)現(xiàn)階段的高通量篩選，屬于免洗的免疫檢測(cè)技術(shù)，已在國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)企業(yè)和科研院所中獲得廣泛認(rèn)可。本文將簡(jiǎn)要介紹 ALPHA 技術(shù)的原理、技術(shù)特點(diǎn)、家族及主要應(yīng)用、多重檢測(cè)以及使用注意事項(xiàng)。

一、Alpha 基本原理

Alpha 技術(shù)使用供體和受體兩種微珠。當(dāng)結(jié)合于供體微珠上的分子 A 與結(jié)合于受體微珠上的分子 B 相互作用，且兩個(gè)微珠距離足夠接近（<200nm）時(shí)，能夠檢測(cè)出發(fā)光信號(hào)。供體微珠表面的光敏劑經(jīng) 680nm 的激光照射后被激發(fā)，將周?chē)难蹀D(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。單線態(tài)氧在溶液中擴(kuò)散，遇到受體微珠后可在受體微珠內(nèi)引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)放大的化學(xué)反應(yīng)，并最終發(fā)射出光。若分子 A 與分子 B 不發(fā)生相互作用，則供體微珠產(chǎn)生的單線態(tài)氧不會(huì)到達(dá)受體微珠，從而不會(huì)引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

二、Alpha 技術(shù)特點(diǎn)

均相檢測(cè)：無(wú)需洗滌步驟，操作簡(jiǎn)便。

較寬檢測(cè)范圍：適合 nM 至 μM 范圍的親和力檢測(cè)。

低背景、高靈敏度：可避免環(huán)境因素的自發(fā)熒光背景干擾。

更適合生物分子檢測(cè)：有效距離可達(dá) 200nm。

更多檢測(cè)因子：適合更多的因子檢測(cè)。

可用于微量檢測(cè)：樣品用量可低至 5 微升。

易于自動(dòng)化檢測(cè)：適合 96、384 和 1536 微孔板規(guī)格。

多重檢測(cè)：可用于多重因子同時(shí)檢測(cè)。

與 ELISA 相比，AlphaLISA 在洗板、實(shí)驗(yàn)步驟、微孔板規(guī)格、自動(dòng)化程度、實(shí)驗(yàn)通量、樣品量、靈敏度、檢測(cè)范圍和性價(jià)比等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且可以進(jìn)行多重檢測(cè)。

三、Alpha 家族及主要應(yīng)用

Alpha 微珠類(lèi)型

Alpha 微珠分為供體微珠（Donor Bead）和受體微珠（Acceptor Bead）。在 Alpha 技術(shù)中，供體微珠相同，經(jīng)激光激發(fā)后可產(chǎn)生單線態(tài)氧分子。受體微珠根據(jù)發(fā)射波長(zhǎng)不同分為四種類(lèi)型：AlphaScreen（紅熒烯，發(fā)射波長(zhǎng) 520 - 620nm）、AlphaLISA（銪 Eu，發(fā)射波長(zhǎng) 615 - 623nm）、AlphaPlex 545（鋱 Tb，發(fā)射波長(zhǎng) 515 - 555nm）和 AlphaPlex 645（釤 Sm，發(fā)射波長(zhǎng) 645nm）。

AlphaScreen 和 AlphaLISA

AlphaScreen 是第一代 Alpha 技術(shù)，受體微珠發(fā)射波長(zhǎng)為連續(xù)的 520 - 620nm 波段。

AlphaLISA 是升級(jí)后的技術(shù)，受體微珠發(fā)射波長(zhǎng)非常窄，峰值在 615nm 附近，可避免很多干擾因素，降低假陽(yáng)性和假陰性。目前，AlphaLISA 產(chǎn)品已替代 AlphaScreen 的大部分產(chǎn)品。AlphaLISA 技術(shù)主要應(yīng)用于蛋白與蛋白相互作用（PPI）、激酶和表觀遺傳學(xué)研究的生化篩選、第二信使檢測(cè)（GPCR）以及生物標(biāo)志物檢測(cè)（Cytokine、Biomarker）等領(lǐng)域。在細(xì)胞因子檢測(cè)中，AlphaLISA 提供 Biotin-Free 版本的檢測(cè)試劑盒，降低細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中生物素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。AlphaLISA 還提供雙重檢測(cè)的試劑盒。

Alpha Surefire 和 Alpha Surefire Ultra

在研究信號(hào)通路的磷酸化蛋白檢測(cè)中，需使用 Alpha Surefire 系列產(chǎn)品。Alpha Surefire Ultra 版本進(jìn)行了兩個(gè)更新設(shè)計(jì)：采用 CaptSure 技術(shù)替代早期版本的 Protein A 鏈接結(jié)構(gòu)，提升抗體捕獲的特異性；改用 AlphaLISA 受體微珠，具有更好的光譜特性。目前，AlphaLISA Surefire Ultra 技術(shù)主要用于信號(hào)分子的總蛋白和磷酸化蛋白檢測(cè)。

四、Alpha 技術(shù)的多重檢測(cè)

Alpha 技術(shù)提供三種發(fā)射波長(zhǎng)的受體微珠，理論上可同時(shí)進(jìn)行三種分子的檢測(cè)，但考慮酶標(biāo)儀配置因素，目前大多數(shù)情況下只能同時(shí)進(jìn)行兩種分子的檢測(cè)。

AlphaLISA 的雙重檢測(cè)

Alpha 技術(shù)一般采用包被 Eu 的受體微珠，對(duì)于部分生物標(biāo)志物的檢測(cè)，也提供 Tb 包被的受體微珠檢測(cè)試劑盒（AlphaPlex），可在一個(gè)微孔板孔內(nèi)檢測(cè)兩種細(xì)胞因子。

Alpha Surefire Ultra 的雙重檢測(cè)

針對(duì)檢測(cè)蛋白的種類(lèi)不同，分為兩種情況：

同一個(gè)靶點(diǎn)的總蛋白和磷酸化蛋白檢測(cè)推薦使用 MPSU 版本（Alpha SureFire Ultra Multiplex），提供套裝試劑盒，可同時(shí)檢測(cè)總蛋白及特定磷酸化蛋白的含量變化。

不同靶點(diǎn)的磷酸化蛋白檢測(cè)需分別購(gòu)買(mǎi)兩種 Surefire Ultra 試劑盒，即 Alpha Surefire Ultra kit（ALSU）和 Terbium SureFire Ultra kit（TBSU），可在一個(gè)孔內(nèi)同時(shí)檢測(cè)不同蛋白的磷酸化水平。目前，Alpha 提供 30 余種 TBSU 的檢測(cè)試劑盒，可與 ALSU 搭配使用。特別提示，TBSU 試劑盒不能單獨(dú)使用。

五、Alpha 技術(shù)使用注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中部分步驟需避光，盡量保持恒溫。

使用時(shí)，盡量按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

微珠試劑不要冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先確認(rèn)酶標(biāo)儀的功能和配置。