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細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，也稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，在感知和整合不同的外部刺激以產(chǎn)生生物反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞過程（增殖、遷移、分化、營養(yǎng)代謝……）。磷酸化反應(yīng)是由激酶介導(dǎo)的翻譯后修飾，控制參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的活性。因此，它是感興趣途徑激活狀態(tài)的反映。

就磷酸化檢測而言，最佳檢測條件不僅取決于所研究的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及所研究的化合物（激活劑或抑制劑）的藥理學(xué)特征，還取決于用于檢測的特定細(xì)胞模型（貼壁或懸浮細(xì)胞、永生化細(xì)胞系或原代細(xì)胞、腫瘤、組織……）。正確優(yōu)化檢測條件對于確保獲得最佳的試劑使用和性能至關(guān)重要。

本文以HTRF®Advanced phospho-ERK1/2kit為例，為廣大研究者提供優(yōu)化磷酸化蛋白檢測的實(shí)用技巧，讓大家更深入地了解如何優(yōu)化過程中的各個(gè)步驟以獲得最佳的檢測結(jié)果。

圖1：Process flow for detecting GPCR-mediated ERK1/2 phosphorylation.Optimize preparation of working cells

TIP1：Optimize cell density for the best signal amplitude（優(yōu)化細(xì)胞密度）

HTRF信號(hào)與處理產(chǎn)生的磷酸化蛋白和總蛋白的量成正比，信號(hào)隨著磷酸化蛋白濃度增加而增加，如果檢測中磷酸化蛋白質(zhì)的量明顯高于孔中存在的檢測抗體的量，則信號(hào)會(huì)下降（鉤狀效應(yīng)）。有必要針對每個(gè)HTRF磷酸化或總蛋白檢測試劑盒、不同的細(xì)胞模型、甚至每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行細(xì)胞密度優(yōu)化，以避免鉤狀效應(yīng)。

圖2：使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit進(jìn)行不同細(xì)胞密度檢測p-ERK，找到檢測最佳信號(hào)窗口的優(yōu)條件。每孔50K細(xì)胞密度會(huì)產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)，而每孔12.5K細(xì)胞密度條件可產(chǎn)生最佳信號(hào)。

TIP2：Optimize the presence of serum in the cell culture medium（血清饑餓處理）

根據(jù)要研究的信號(hào)通路，細(xì)胞饑餓處理可能有利于減少目標(biāo)蛋白質(zhì)的本底水平。通常情況下，從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除血清是使細(xì)胞饑餓的有效方法，但對于某些細(xì)胞模型來說，血清的存在對于細(xì)胞生長或增殖至關(guān)重要。在這種情況下，可以選擇將血清濃度降低至0.5% 或不高于2%，同時(shí)應(yīng)優(yōu)化血清饑餓的時(shí)間。

圖3：在此實(shí)驗(yàn)中，2小時(shí)血清饑餓步驟（紅色曲線）實(shí)現(xiàn)了最佳的p-ERK檢測（S/B和EC50）。

TIP3：Distribute compounds in the presence of cell culture medium（在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的情況下進(jìn)行加藥處理）

在將化合物/藥物分配到細(xì)胞上之前，請勿從微孔板中除去細(xì)胞培養(yǎng)基。加藥步驟中去除培養(yǎng)基會(huì)對某些磷酸化蛋白檢測產(chǎn)生不良影響。在去除培養(yǎng)基加藥的情況下，高本底水平基本上掩蓋了任何誘導(dǎo)的藥理學(xué)劑量反應(yīng)的檢測；當(dāng)培養(yǎng)基存在的情況下加藥時(shí)，本底水平較低并且可以檢測到劑量反應(yīng)（見圖4）。

圖4：直接加藥或去除培養(yǎng)基后加藥的檢測對比。結(jié)果表明，為了正確檢測劑量反應(yīng)，必須在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的情況下直接加藥處理。

TIP4：Optimize stimulation time（化合物刺激時(shí)間）

評(píng)估化合物刺激時(shí)間，找出產(chǎn)生最佳信號(hào)窗口的時(shí)間。

圖5：不同藥物刺激時(shí)間后，使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit檢測p-ERK。結(jié)果表明，刺激細(xì)胞時(shí)間過短或時(shí)間過長都可能會(huì)降低信號(hào)窗口。

TIP5： Add lysis buffer shortly after removal of stimulation medium（藥物處理結(jié)束后盡快加入lysis buffer）

去除刺激介質(zhì)后延遲添加裂解緩沖液可能會(huì)影響化合物的劑量反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)中，在去除刺激緩沖液后延遲不同時(shí)間后加入裂解液—— 5、10或30分鐘。結(jié)果顯示當(dāng)延遲添加裂解緩沖液時(shí)，會(huì)對磷酸化ERK的檢測到產(chǎn)生不利影響。

圖6：在裂解步驟之前去除刺激緩沖液后等待時(shí)間的影響，去除培養(yǎng)基后必須立即添加裂解緩沖液。

通過上述實(shí)用技巧分享希望能夠幫助大家獲得最佳的檢測結(jié)果，此外，瑞孚迪磷酸化檢測不僅提供HTRF方案還有Alpha方案，同時(shí)還有干貨滿滿的優(yōu)化指南供大家參考，如有需要，就請與我們聯(lián)系吧