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前言多年以來(lái)，紫外-可見分光光度計(jì)一直是生物技術(shù)領(lǐng)域中測(cè)定 DNA 純度和濃度的一項(xiàng)重要工具。該方法最早由 Warburg 和 Christian 在 1942 年開發(fā) 1，隨后由Sambrook 等人在 1989 年進(jìn)行了優(yōu)化，使其可用于實(shí)驗(yàn)室中簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定 2。分光光度法的主要優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)定過(guò)程： 1) 簡(jiǎn)便；2) 準(zhǔn)確； 3) 不破壞樣品。這一方法可以節(jié)省時(shí)間而不損失數(shù)據(jù)質(zhì)量，并且在測(cè)定過(guò)程中無(wú)需使用大體積的樣品或額外的耗材，從而帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。

 

在之前的文章中，我們介紹了安捷倫 Cary 50 紫外-可見分光光度計(jì)配置 Hellma（德國(guó) Hellma GmbH & Co.）的Traycell 微量比色池紫外-可見在室溫下準(zhǔn)確、可重現(xiàn)地測(cè)定微量 DNA 的方法 3。在本研究中，我們采用帶光纖探頭的Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行了方法擴(kuò)展研究，在 4 °C以及普通實(shí)驗(yàn)室環(huán)境光照條件下測(cè)定了小體積樣品。本方法使得用戶可以將儀器靠近樣品，而不是像傳統(tǒng)光譜方法那樣將樣品放入儀器中，從而能夠在很短的時(shí)間內(nèi)完成分析。Cary 60 的光學(xué)設(shè)計(jì)使這一優(yōu)勢(shì)得以實(shí)現(xiàn)，它主要憑借其的高強(qiáng)度閃爍氙燈以及新型的電子器件，使系統(tǒng)能夠有效地監(jiān)控吸光度的微小變化而不受環(huán)境背景光的任何影響。本文深入討論了這一方法的主要優(yōu)點(diǎn)。

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方法與結(jié)果將小牛胸腺 DNA 用純凈水（MilliQ）稀釋得到不同濃度的樣品，濃度范圍 0–50 µg/ml。配有光纖耦合器以及微探頭的 Cary 60, 如圖 1 所示。在Eppendorf 管中加入 150 µL 純凈水（MilliQ），將其讀數(shù)作為空白。由于分子生物學(xué)試劑通常保存于冷藏條件下，因此所有樣品直接從 4 °C 冰箱中取出并進(jìn)行分析。

討論測(cè)定五個(gè)樣品所用的時(shí)間不到兩分鐘。傳統(tǒng)方法使用微量比色皿，需要等待樣品加熱至室溫，而且在每?jī)纱螠y(cè)定間需要清洗微量比色皿?？傊?，使用 Cary 60 光纖系統(tǒng)可以顯著降低大約 80% 的分析時(shí)間，同時(shí)采用光纖技術(shù)不易受到樣品處理引起的潛在污染。使用微探頭可以獲得高精度的數(shù)據(jù)并大大縮短測(cè)定低溫樣品所需的時(shí)間，這表明 Cary 60是一種適于測(cè)定生物樣品（如 DNA）的簡(jiǎn)便、快速且高性價(jià)比的系統(tǒng)。本方法可以輕松地直接擴(kuò)展到其它樣品類型，例如可在 280 nm 處測(cè)定蛋白質(zhì)

 

結(jié)論Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)是使用光纖采樣的理想儀器，它高強(qiáng)度閃爍氙燈可以提供靈敏度和重現(xiàn)性。本應(yīng)用報(bào)告所展示的測(cè)定 DNA 樣品時(shí)的分析速度、結(jié)果重現(xiàn)性以及易用性證明了該儀器系統(tǒng)的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。使用帶光纖的 Cary 60 分析生物樣品還具有如下優(yōu)點(diǎn)：• 可以直接測(cè)定高溫或低溫樣品（4 °C – 110 °C）而無(wú)需考慮冷凝的問(wèn)題，如果使用比色皿則由于冷凝可能導(dǎo)致結(jié)果不正確或重現(xiàn)性不好• 樣品體積不受限制，可以低至 40 µL，也可以無(wú)限大• 無(wú)需購(gòu)買昂貴的石英微量比色皿，更節(jié)省了清洗比色皿的時(shí)間• 使用反射探頭還可以分析固體、粉末或凝膠類樣品