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使用紫外-可見光譜法對蛋白質和核酸超微量樣品進行濃度分析
閱讀：296 發(fā)布時間：2024-11-14摘要使用配備 TrayCell 2.0 超微量比色池的 Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計分析了蛋白質和核酸樣品。無損測量微量樣品有利于樣品保存、樣品處理，并且無需執(zhí)行繁瑣且容易出錯的稀釋操作。使用 TrayCell 2.0 既快捷又簡單，可幫助用戶改進工作流程。
前言現(xiàn)代化實驗室越來越多地在尋求無需稀釋即可分析 DNA、RNA 和蛋白質等樣品的準確、精確且易于使用的方法。Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計配備 TrayCell 2.0 超微量比色池，該比色池帶有合適光程的蓋子，為直接測量超微量樣品提供了一個方便且易于使用的平臺?？梢苑謩e使用短光程和長光程蓋子分析高濃度和低濃度樣品，確保寬動態(tài)范圍。該方法是一種無損分析方法，可以回收珍貴的樣品，并且 TrayCell2.0 易于清潔，提高了該技術的可用性。Cary 60 紫外-可見分光光度計（圖 1）專為重復的常規(guī)應用以及更高級的應用而設計。這款雙光束儀器配備強大、高度聚焦的脈沖氙燈。這種燈可大幅提高穿過樣品的光通量，確保高質量的光度測量結果。因此，Cary 60 紫外-可見分光光度計是準確且可重現(xiàn)地測量少量樣品的理想之選。脈沖氙燈僅在采集數(shù)據(jù)時照射樣品，保護敏感樣品免受光降解并降低功耗。此外，Cary 60 紫外-可見分光光度計不受室光干擾帶來的失真影響。Cary 60 紫外-可見分光光度計的室光免疫性能支持在開放的樣品室中操作，易于使用，并且降低了由于處理錯誤而導致數(shù)據(jù)質量降低的風險。與因儀器限制而可能產生不準確或不可重復結果的現(xiàn)有方法相比，高性能 Cary 60 紫外-可見分光光度計可提供更優(yōu)質的數(shù)據(jù)。
邁向更可持續(xù)發(fā)展的實驗室Cary 60 紫外-可見分光光度計的環(huán)境影響已經過獨立審計，并獲得了由 My Green Lab 認證的 ACT（歸責性、一致性和透明度）標簽。該標簽提供了有關 Cary 60 紫外-可見分光光度計在其整個生命周期中對環(huán)境影響的信息（圖 2）。Cary 60 紫外-可見分光光度計改善了實驗室對環(huán)境的影響，而不會影響分析效率或科學進步。
在典型的吸光度測量中，TrayCell 2.0 超微量比色池（貨號 G6871C）置于 Cary 60 紫外-可見分光光度計的標準樣品池支架中。TrayCell 2.0 可以配備可更換蓋，提供四種不同的光程：2.0 mm（貨號 G6871-68005）、1.0 mm（貨號G6871-68004）、0.2 mm（貨號 G6871-68003）和 0.1 mm（貨號 G6871-68002），具有寬動態(tài)范圍。將超微量樣品（0.7–10 μL，取決于光程）吸取至 TrayCell 2.0 的測量窗，然后將具有選定光程的相應蓋子置于上方。來自 Cary 60 紫外可見分光光度計的高度聚焦光束經過 TrayCell 2.0 中的光纖直接穿過樣品（圖 3）。然后，光束被蓋子中的反射鏡反射回到分光光度計檢測器中，重新穿過樣品，如圖 4 所示。
在將下一個樣品置于 TrayCell 2.0 的測量窗之前，需要清潔窗片以及蓋子內的反射鏡。在清潔窗片期間，無需從樣品池支架上取下 TrayCell 2.0。窗片與蓋子內的反射鏡之間準確的間距可確保準確的光程，并在每次測量中保持不變。在本研究中，使用配備 TrayCell 2.0 超微量比色池的 Cary 60紫外-可見分光光度計測量超微量蛋白質和 DNA 樣品。使用TrayCell 2.0 的不同光程蓋選件，以減少稀釋，并擴展樣品的可測量濃度范圍。使用牛血清白蛋白 (BSA) 和鯡魚精子 DNA樣品，展示了配備 TrayCell 2.0 的 Cary 60 紫外-可見分光光度計的光度測量性能。
儀器和材料– Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計– TrayCell 2.0 超微量比色池– BSA 蛋白：將已知量的 BSA 蛋白（Sigma-Aldrich，CAS9048-46-8）溶解于 PBS 緩沖液（磷酸鹽緩沖液）中，配制 400 mg/mL 儲備液。連續(xù)稀釋儲備液，配制一組不同濃度的樣品– 鯡魚精子 DNA：將已知量的鯡魚精子 DNA（Sigma-Aldrich，CAS 438545-06-3）溶解于 PBS 緩沖液中，配制 5 mg/mL儲備液。連續(xù)稀釋儲備液，配制一組不同濃度的樣品使用移液器將超微量 (3 µL) 樣品置于測量窗上，并使用 AgilentCary WinUV 軟件 5.1.3.1042 版進行數(shù)據(jù)采集。
結果與討論低濃度下的光度測量重現(xiàn)性為了評估配備 TrayCell 2.0 的 Cary 60 紫外-可見分光光度計的可用吸光度范圍，對高濃度和低濃度樣品進行了測量。對于樣品量有限的低濃度測量，TrayCell 2.0 是理想之選，因為它只需要超微量樣品即可進行測量。此外，Cary 60 紫外-可見分光光度計足夠靈敏，可以測量低濃度樣品，而許多分光光度計的靈敏度不支持測量濃度低于 25 ng/µL 的樣品。分光光度計在低濃度下的性能至關重要，因此需要執(zhí)行波長掃描以確保觀察到典型的樣品曲線。使用配備 TrayCell 2.0（帶 1.0 mm蓋子）的 Cary 60 紫外-可見分光光度計對 20 ng/µL 鯡魚精子DNA 樣品進行十次重復波長掃描。該樣品的吸光度為 0.04，相當于標準 10 mm 比色池中的 0.4 Abs。如圖 5 所示，Cary60 紫外-可見分光光度計可進行高度可重現(xiàn)的波長掃描，這對于超微量分析十分重要。