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重組人EGF的制備方式涉及基因工程、蛋白質(zhì)表達及純化技術(shù)。在現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域，重組人EGF的制備主要通過大腸桿菌等表達系統(tǒng)實現(xiàn)。這一過程包括基因合成、構(gòu)建表達載體、轉(zhuǎn)化宿主細胞、誘導(dǎo)表達以及蛋白純化等關(guān)鍵步驟。具體介紹如下：
1.表達系統(tǒng)的選擇和基因合成：
表達系統(tǒng)選擇：常用于生產(chǎn)重組人EGF的表達系統(tǒng)是大腸桿菌（Escherichia coli），這是因為其具有快速生長、操作簡單、成本低廉等特點。
基因合成與克隆：人工合成人EGF基因或者從人類基因組中提取EGF基因，然后將其插入到合適的表達載體中，這些載體通常會引入特定的標簽序列（如His標簽），以便后續(xù)的純化工作。
2.融合蛋白的表達及純化：
融合蛋白表達：為了增強EGF的可溶性和簡化純化流程，通常會將EGF基因與某種融合標簽（如SUMO蛋白）結(jié)合表達為融合蛋白。這種融合蛋白可以提高目標蛋白的穩(wěn)定性并降低被宿主細胞內(nèi)蛋白酶降解的風(fēng)險。
蛋白純化：利用融合標簽與金屬離子的親和性，通過親和層析方法（例如鎳柱親和層析）來純化融合蛋白。然后通過特定的蛋白酶識別位點將融合標簽與EGF切割分離，從而得到高純度的EGF蛋白。
3.蛋白折疊和活性檢測：
蛋白重新折疊：由于大腸桿菌表達系統(tǒng)缺乏真核生物的蛋白折疊機制，因此重組蛋白通常以包涵體形式存在。需要通過重新折疊的過程，使人EGF恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性。
活性檢測：采用生物活性測定方法（例如，利用Balb/C 3T3小鼠胚胎成纖維細胞進行細胞增殖試驗）來驗證人EGF的生物活性，確保其具備正常的生物學(xué)功能。
4.蛋白的保存和包裝：
保存條件：純化后的重組人EGF一般保存于-20℃以下的環(huán)境中，以防止蛋白質(zhì)降解或失去活性。
產(chǎn)品包裝：根據(jù)實際用途進行分裝，并確保全程無菌操作，以免污染。
