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酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實驗操作重點之一加樣解讀
閱讀：275 發(fā)布時間：2025-1-7 酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實驗室技術(shù)。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別，信號輸出和數(shù)據(jù)處理。
ELISA實驗測定操作簡單，一般涉及到樣本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。
一、ELISA實驗加樣過程：
ELISA實驗中一般需要 4 次加樣，即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。
ELISA加樣
● 實驗室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會導(dǎo)致最后讀數(shù)差別，因此避免儀器帶來誤差。
● 加樣前，溶液充分混勻，加樣時不可90度向孔中滴加液體，否則會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。
● 加樣品時，單孔用量要求：≥50ul/指標(biāo)，如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。
● 加樣時速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準確性和均一性。
● 加樣時避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄。
● 每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個孔顯色時間相同。
● 加完顯色液后，放入一個可推拉的抽屜內(nèi)，就可以避光振蕩了。
二、ELISA實驗加樣技巧：
● 用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。
● 可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。
三、ELISA實驗加樣問題解答：
以下問題可能因多種原因引起，本文僅討論加樣的解決方法：
Q： 同一個樣本間的各個復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異？
A： 加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復(fù)同一樣本時，加樣量與加樣時間理應(yīng)相同，同時也應(yīng)注意移液器的校準。加樣后可輕微晃動酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。
Q： 陽性對照讀數(shù)不正常？
A： 加樣量不正確。應(yīng)保持每次加樣的步驟不要有太大的差異，有條件的應(yīng)該考慮使用排槍。
Q： 血清本底高？
A： 加樣時使用同一槍頭、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染。
Q： 實驗的標(biāo)準曲線和測定的重復(fù)性差？
A： 1. 可能原因：加樣本及試劑量不準；孔間不一致；校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密；重復(fù)某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近；重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。
2. 可能原因：加樣過快，孔間發(fā)生污染；重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快。
3. 可能原因：加錯樣本；檢查記錄和試劑，是否加錯樣本。
4. 可能原因：加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)；加樣槍頭不要貼壁。