LBA4404農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

  LBA4404 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品編碼：                          保存條件： -80℃   
產(chǎn)品規(guī)格:

                

LBA4404農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞基因型：
Ach5 (rif ^R) Ti pAL4404 (strep^R) Octopine

LBA4404農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞簡(jiǎn)要說(shuō)明：
 LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒pAL4404，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。 
pAL4404型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：strep，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。開(kāi)發(fā)的LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒(size:11633bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10⁴cfu/μg；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒（size:40kd）檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10³cfu/μg。
 

LBA4404農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞操作說(shuō)明:

1. 0.2cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

1.  取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5ug質(zhì)粒DNA（質(zhì)粒體積不大于6ul，用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手管底混勻，立即插入冰中，用200ul槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。
2.  啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25uF，PC=200ohm，V=2400V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700ul 無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50ug/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時(shí)加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。

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