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高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒
高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）規(guī)格：50T/盒
配件
高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）的組成
產品簡介
詳細介紹
高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒
高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）規(guī)格：50T/盒
配件
高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）的組成
2. 標本采集，方法如下：注：陰性對照為基因組DNA，陽性對照為失去活性的病毒cDNA。
儲存方式
避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器 】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
標本要求
1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液。
(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉至5ml 的干燥管中，密閉送檢。
(2) 腸內容物：無菌條件下取腸道內容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。
(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。
3.應避免標本間交叉污染。
4.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器 上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器 上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器 核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
操作流程
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集病毒熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
反轉錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
適用范圍 【參考值】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的*檢出*可能會發(fā)生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果。
【產品性能指標】 高致病性豬藍耳病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）的*檢出限為102 Copies/mL，產品CV值≤5%。
操作流程
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器 、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。
3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
7. 儀器 擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。