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豬瘟檢測(cè)試劑盒

豬瘟E2（CSFV-E2）抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，可以從豬的血液樣品中檢測(cè)到CSFV-E2抗體的量。微量板用CSFV-E2蛋白包被，將稀釋的豬血清樣品加入到微量孔中，樣品中CSFV-E2抗體將與包被的抗原形成抗原抗體復(fù)合物。非特異性抗體和其它血清蛋白被洗去。將堿性磷酸酶標(biāo)記的抗豬IgG抗體加入孔中，與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后再洗去未反應(yīng)的結(jié)合物。PNPP顯色劑作為底物被加入，如果CSFV-E2抗體存在，則顯黃色。顏色強(qiáng)度直接與樣品中的該抗體的量有關(guān)。

提供的試劑

包被板（Coated plates）：包被重組豬瘟E2蛋白抗原的微量板。

酶標(biāo)二抗(Conjugate reagent)：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗豬抗體：內(nèi)含蛋白穩(wěn)定劑紅色染料的磷酸鹽緩沖液。

底物片(Substrate tablets) PNPP（4-**苯磷酸二鈉鹽）：用底物緩沖液溶解后使用。

底物緩沖液(Substrate buffer)：含有與酶反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)的二乙醇胺緩沖液。

終止液(Stop Solution)：含有NaOH的二乙醇胺緩沖液。

樣品稀釋液(Sample Diluent)：含有蛋白穩(wěn)定劑

洗液(Wash Buffer)：含有吐溫的磷酸鹽緩沖液（粉）。

陰性對(duì)照(Negative Control)：滅活的無(wú)CSFV抗體的磷酸鹽緩沖液：內(nèi)含有蛋白穩(wěn)定劑和die氮化鈉防腐劑（0.1% 重量/體積）及藍(lán)色染料。

陽(yáng)性對(duì)照(Positive Control)：含特異性CSFV抗體的磷酸鹽緩沖液：內(nèi)含有蛋白穩(wěn)定劑和die氮化鈉防腐劑（0.1% 重量/體積）及紅色染料。

材料和設(shè)備要求（試劑盒未提供）

精確的微量移液器和一次性吸頭

8或12孔道的微量移液器

稀釋樣品的塑料管

蒸餾水或去離子水

含405nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀

注意事項(xiàng)

1．處理各種試劑要小心。終止液中含有腐蝕性的強(qiáng)堿，如果濺到皮膚或眼中，用大量的清水洗滌。

2．把各種生物材料都看成具有潛在的生物危險(xiǎn)性物，包括所有的外來(lái)樣品。在銷毀之前，要用漂白粉或其它強(qiáng)氧化劑，將用過(guò)的反應(yīng)板和廢棄液進(jìn)行消毒。

3．不要用嘴碰移液器。在使用試劑盒中的試劑和處理樣品的地方，不要吃東西，喝水或吸煙。

4．試劑盒僅供體外使用。

5．嚴(yán)格按照檢測(cè)規(guī)程操作才能取得較好的結(jié)果。

試劑的準(zhǔn)備

1．底物試劑：取1片底物放入潔凈容器中，加入5.5-6ml的底物緩沖溶液，混合直到*溶解。本試劑很好是現(xiàn)用現(xiàn)配，配置好的底物溶液可以在+4℃下避光保存1周。請(qǐng)勿用手直接觸拿底物片。

2．洗液：將1袋洗液*倒入1升蒸餾水或去離子水中，混合使其*溶解。洗液可在+4℃保存1個(gè)月。

3．試劑盒中的其它成分可以直接使用，使用前要回溫至室溫（22-27℃）。

樣品的準(zhǔn)備

每個(gè)樣品按照1:30稀釋，即在樣品稀釋板上用10μl樣品加290μl的樣品稀釋液，并在預(yù)稀釋板上記錄好樣品和對(duì)照的位置。

1．用旋渦混合器或振蕩器混合均勻。

2．每份樣品都要換一個(gè)未用過(guò)的新的吸頭。

試劑盒中的陽(yáng)性和陰性對(duì)照不要稀釋??！

BioChek公司的CSFV-E2試劑盒可以通過(guò)兩種方式來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：一種是樣品孵育過(guò)夜來(lái)提高其敏感性；另一種是孵育較少時(shí)間來(lái)進(jìn)行快速診斷。

雙重測(cè)試操作步驟

1．從密封袋中取出用CSFV-E2包被的反應(yīng)板，在記錄紙上記錄樣品的位置。

2．在A1和B1孔中加入100μl的陰性對(duì)照。

3．在C1和D1孔中加入100μl的陽(yáng)性對(duì)照。

4．將100μl稀釋好的樣品加入到相應(yīng)的板孔中，用蓋子蓋住反應(yīng)板，在室溫（22-27℃）下孵育60分鐘。孵育過(guò)夜（4-8℃）來(lái)提高其敏感度。

5．倒出孔中的內(nèi)容物，用洗液洗4次(每孔300μl)。后一次倒轉(zhuǎn)反應(yīng)板，在吸水紙上輕輕拍打。

6．各孔加100μl酶標(biāo)二抗，用蓋子蓋住反應(yīng)板，在室溫（22-27℃）下孵育30分鐘。

7．重復(fù)步驟5。

8．各孔加100μl底物試劑，用蓋子蓋住反應(yīng)板，在室溫（22-27℃）下孵育15分鐘。

9．各孔加100μl終止液，終止反應(yīng)。

10．空氣調(diào)零，以405nm的波長(zhǎng)于酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度。

結(jié)果

為確保試驗(yàn)有效，陰性對(duì)照的平均吸光度應(yīng)該小于0.35，陽(yáng)性對(duì)照的平均值和陰性對(duì)照的平均值之差應(yīng)大于0.15。

實(shí)驗(yàn)室中溫度的差異會(huì)造成OD值的偏高或偏低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)的有效性。

結(jié)果判定

樣品中抗體的相對(duì)含量可以參考陽(yáng)性對(duì)照來(lái)計(jì)算，其關(guān)系可以通過(guò)S/P值（樣品和陽(yáng)性對(duì)照的比值）來(lái)計(jì)算。

1．S/P值的計(jì)算

樣品的S/P值大于或等于0.5認(rèn)為是陽(yáng)性。

2．抗體滴度的計(jì)算

Log₁₀效價(jià)＝1.1×Log₁₀S/P + 3.361

逆對(duì)數(shù)＝效價(jià)

3．判定標(biāo)準(zhǔn)

S/P值效價(jià)范圍抗體狀況

≤0.499    ≤1070    陰性

≥0.500    ≥1071   陽(yáng)性