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Dispase II 分散酶II（中性蛋白酶）的使用方法
閱讀：1305 發(fā)布時間：2022-11-28使用方法
一、儲存液和工作液制備
1）儲存液制備：用Hepe緩沖鹽溶液（50 mM Hepes/KOH pH7.4, 150 mM NaCl）溶解Dispase II凍干粉，配制成10mg/ml的儲存液，用0.22µM濾膜過濾除菌。本儲存液置于2-8℃，2周穩(wěn)定；根據(jù)單次用量分裝凍存，高達2個月穩(wěn)定，避免反復(fù)凍融。
2）工作液制備：使用時用合適的細胞培養(yǎng)液將儲存液稀釋到工作液濃度即可，常用工作濃度為0.6-2.4 U/ml。不推薦使用>2.4 U/ml的工作濃度。具體使用濃度請根據(jù)自身實驗體系或參考文獻來調(diào)整。
二、組織分離
1）用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm小片，之后用無菌PBS緩沖液清洗組織片幾次；
2）用Dispase II工作液（0.6-2.4 U/ml）浸沒并37℃孵育進行組織解離；
3）置于水平搖床上，低速轉(zhuǎn)動，37℃孵育直至組織 完/全 解離；【注意】：第一次使用Dispase II，通過細胞計數(shù)來確定總反應(yīng)時間。對于堅硬致密組織需要1h的孵育時間，不過孵育時間幾小時也不會有副作用。
4）若有需要，將消化產(chǎn)物用無菌不銹鋼網(wǎng)過篩，從而分離解散細胞和殘留組織，或當(dāng)更大片段組織靜置到管底，輕輕倒出上層細胞。若需要進一步解離，則加入新鮮的Dispase II工作液到殘留組織。
5）低速離心收集細胞，吸掉酶工作液；
6）用適當(dāng)?shù)募毎囵B(yǎng)液重懸細胞，置于正常預(yù)優(yōu)化條件下培養(yǎng)。
三、細胞亞培養(yǎng)
1）用37℃預(yù)熱的Dispase II工作液完/全覆蓋細胞，置于37℃孵育5min；
2）吸掉溶液，于37℃再孵育10min；
3）顯微鏡觀察以確定消化情況，若有需要，可再孵育15min；
4）用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，低速離心并用培養(yǎng)基清洗細胞幾次；
5）用新鮮細胞培養(yǎng)液重懸細胞；
6）按照常規(guī)方法進行分盤傳代。
注意事項
1）Dispase是Godo Shusei Co., Ltd.的注冊商標(biāo)。
2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。