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siRNA轉(zhuǎn)染操作及要點(diǎn)
閱讀：369 發(fā)布時(shí)間：2024-8-20siRNA（小干擾RNA）是一種新型的基因治療工具，是由21-25個(gè)核苷酸組成的雙鏈短RNA分子，能夠特異性地誘導(dǎo)靶基因的沉默，進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá)。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出，之后在2001年被證明可以特異性地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的靶基因表達(dá)。
siRNA的抑制作用是通過其與AGO蛋白組裝成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）發(fā)揮的。一條鏈被降解，另一條鏈則與靶基因的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，使其被切割降解，從而達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。與傳統(tǒng)的基因治療相比，siRNA具有高度特異性、快速、可逆性等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。例如siRNA靶向惡性腫瘤的基因可以通過局部或系統(tǒng)性給藥來治療腫瘤，病毒感染和遺傳疾病也都有涉及。
為了方便使用，常規(guī)siRNA產(chǎn)品以凍干粉形式提供，可以直接用于各種細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)?？蒲腥藛T可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)特定靶點(diǎn)，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因。同時(shí)，通過對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，可以提高其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的高效性、特異性和穩(wěn)定性。
RNA干擾（RNAi）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，常常被用作基因沉默（基因干擾）的工具之一。siRNA作為RNAi的一種形式，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。未來，siRNA還將繼續(xù)發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，成為治療相關(guān)疾病的新趨勢(shì)。
siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)介紹
01- siRNA儲(chǔ)存
常規(guī)化學(xué)合成的siRNA序列為21～23nt的雙鏈小分子RNA，為凍干粉形式的即用型試劑 ，在常溫不溶解的情況下可以保存至少1個(gè)月時(shí)間，放置于-20℃～-80℃低溫環(huán)境中，凍干粉可以穩(wěn)定保存一年。
02- 轉(zhuǎn)染試劑儲(chǔ)存
4℃保存，不可冷凍。
03-體外轉(zhuǎn)染操作流程：
第一步、接種細(xì)胞：建議提前一天接種細(xì)胞，接種數(shù)量參考下方推薦量。
第二步、 轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：
● siRNA稀釋液配制：siRNA以水稀釋至140 μg/mL。
● siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：取無菌離心管，加入2μL siRNA稀釋液，加入LipidnanoTM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑A液14μL，吹打混勻，加入LipidnanoTM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑B液4μL，混合均勻，室溫放置5min，加培養(yǎng)液180μL，吹打混勻。
第三步、細(xì)胞加樣：按下方推薦量將配制好的siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液加入各細(xì)胞孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。
第四步、細(xì)胞培養(yǎng)：37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至發(fā)揮干擾作用。建議24~48h測(cè)定mRNA水平、48~72h測(cè)定蛋白水平。