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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)
閱讀：233 發(fā)布時(shí)間：2025-1-2一: 細(xì)胞培養(yǎng)
熒光顯微鏡對(duì)于直接用培養(yǎng)皿拍攝都沒有什么壓力，不過依然更建議做爬片，不僅效果更好而且更適合拍共聚焦，不想拍了也可以冷凍保存。爬片的預(yù)處理需要用多聚賴氨酸增加細(xì)胞粘附性
1，用多聚賴氨酸涂在爬片上放置30-120分鐘。
2，然后用滅菌的超純水清洗和浸泡,。
3，自然干燥了之后放在紫外下照射至少1個(gè)小時(shí)以上。爬片之前經(jīng)過高溫滅菌的可以不需要這么久。
4，如果用普通蓋玻片而不是專用細(xì)胞爬片的話，一般還需要用0.1% Tween-20的PBS洗一下，因?yàn)楦鶕?jù)我的經(jīng)驗(yàn)，幾個(gè)牌子的普通蓋玻片都比較臟，不能直接用。
5，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴100uL左右的培養(yǎng)基，然后把爬片貼上去，這樣可以貼的很牢固也沒有氣泡。
6，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，如果你的細(xì)胞貼壁能力很強(qiáng)，比如用胰酶都要消化3min以上的，可以不需要第一步。
二：細(xì)胞固定，通透和染色
這幾個(gè)也是免疫組化的步驟，就不用解釋了。直接說流程
1，4%多聚甲醛孵育細(xì)胞10min?；蛘哂梅旁?20℃預(yù)冷的甲醇孵育5min。這兩個(gè)都是常規(guī)固定液，非常規(guī)的也有甲醛，乙醇和丙酮等。
2，用提前在4℃或者冰上預(yù)冷的PBS洗三次，不要太用力。
3，抗原修復(fù)。不要驚訝，就是抗原修復(fù)?；旧虾苌儆腥藭?huì)這么做，但是細(xì)胞免疫熒光里增加了抗原修復(fù)的步驟會(huì)讓抗體更容易染上，很多做不出來的抗體都可以做出來。過程就是堿性尿素緩沖液在95℃水浴10min，自然冷卻即可。
4，透化。這個(gè)步驟取決于你的抗體針對(duì)的是不是胞內(nèi)蛋白，膜蛋白不需要這個(gè)步驟。常規(guī)透化劑是0.1% Triton X-100的PBS。透化10分鐘然后用PBS洗干凈。
5，封閉。封閉液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物種的血清。BSA的濃度只要1%就可以，血清只要10%即可。如果你是用甲醛類做固定液，那么還需要22mg/ml的甘氨酸添加到封閉液里。如果你的一抗結(jié)合力很強(qiáng)或者二抗有非特異性結(jié)合，那么添加0.1%吐溫20。
6，用封閉液稀釋一抗，4℃過夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗，二抗?jié)舛却蠹s1抗的十倍。最后染DAPI（1ug/ml）1分鐘。
7，PBS洗三遍，用抗淬滅封片劑封片。邊緣處滴兩滴指甲油。就可以拍照了。