一、原理差異

免疫組化：融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和組織學(xué)技術(shù)（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來對組織（細胞）內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))進行定位、定性及相對定量的研究(主要是定位)。樣本是細胞或組織，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。

免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。先要進行SDS-PAGE，然后將分離開的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測樣品，可以用于定性和半定量。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

二、實驗?zāi)康?/strong>

免疫組化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位檢測分析

1.定位較直接準確

2.定性靈敏度高

3.半定量（高質(zhì)量染色，背景淺，特異性強的切片；表達量較多的蛋白）

免疫印跡試驗 Western blot

1.測樣品內(nèi)蛋白含量，定量較IHC更準確

2.定性和間接定位，敏感性遠遠低于免疫組化技術(shù)

三、實驗準備

（一）免疫組化實驗樣本
（新鮮，固定方式，充分脫水，防脫處理）

1.取材新鮮，及時固定：防止離體太久而發(fā)生組織自溶長菌，抗原擴散或丟失，易保存

2.固定液：

（1）醛類：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，穿透性強，組織收縮少；醛基與蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇不能充分暴露，需要抗原修復(fù)

- 4%多聚甲醛（常用，適用大多數(shù)組織，細胞）

- 10%福爾馬林/甲醛（常用，脂肪類，脊髓類）

-戊 二 quan（微細結(jié)構(gòu)保存好，用于電鏡）

（2）醇類：穿透性強，脫水性強，易引起組織收縮，使蛋白變性作用輕，抗原可流失。

-乙醇，甲醇

（3）其他固定劑

-丙酮，抗原保存性好，脫色性更強，常用于部分細胞爬片

-混合固定劑，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固定時間：醛類建議24小時以內(nèi)，醇類，丙酮2小時以內(nèi)，組織大小厚度略有差異

3. 充分脫水：保存時間長，防止裂片，保持組織結(jié)構(gòu)，防止冰切形成冰晶

4. 防脫處理：防止掉片，多聚賴氨酸防脫切片，明膠和硫酸鉻鉀處理等

免疫組化切片類型

1.石蠟切片

易保存（干燥低溫4~8℃保存），厚度3~6um，結(jié)構(gòu)形態(tài)好，需要抗原修復(fù)，抗原活性偏低（烤片，固定等）

2.冰凍切片

不易保存（-80℃保存半年），厚度10~20um，形態(tài)結(jié)構(gòu)較差，抗原活性高，不一定抗原修復(fù)，胞內(nèi)核內(nèi)抗原需打孔

冰凍切片是否需要抗原修復(fù)？如何固定？

（1）不能及時切片染色觀察：可選擇固定（24小時內(nèi)）后切片，需要修復(fù)；或馬上包埋切片后固定（10 min以內(nèi)），可修復(fù)可不修復(fù)

（2）馬上切片染色觀察的，可不固定，可不修復(fù)

3.細胞爬片（貼壁，半貼壁，懸?。?/span>

單層細胞，均勻爬片，選擇合適的固定方式保證細胞形態(tài)，細胞周期同一化，不需要修復(fù)---培養(yǎng)皿/平板 ---蓋玻片爬片

（二）實驗準備-WB實驗樣本

1.新鮮制備，低溫 裂解 （全蛋白，不包括核抽提、亞細胞器分離等）

2.裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑

3.研磨（組織），液氮（小體積組織），超聲波（細菌/細胞）

4.跑膠，蛋白定量

注意事項：

1.防止蛋白降解，磷酸化蛋白防止去磷酸化

2.濃度低蛋白量少不易檢測，濃度高裂解液粘稠不易吸取

3.分泌型蛋白，無血清細胞培養(yǎng)收集上清，TCA沉淀富集