EV-Save™ 細胞外囊泡吸附抑制劑WAKO

EV-Save™ 細胞外囊泡吸附抑制劑WAKO

各品牌都將脂質(zhì)、核酸或細胞膜的熒光標記試劑加以改造，使之成為包括外泌體在內(nèi)的細胞外囊泡的特異熒光標記試劑。該標記方法是讓從各個樣品中分離、提取出來的外泌體樣品與熒光色素進行反應(yīng)，通過凝膠過濾或超濾裝置去除未反應(yīng)的熒光色素。在該熒光標記的過程中，特別是去除未反應(yīng)的熒光標記時，會因吸附而損失大量的外泌體樣品，同時，通過向外泌體樣品添加FUJIFILM Wako開發(fā)的EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent（下面簡稱EV-Save），能強烈抑制吸附損失（圖1）。用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS從COLO201細胞培養(yǎng)上清中分離、提取外泌體樣品，先用A公司的熒光標記試劑進行標記，然后用B公司的凝膠過濾柱去除未反應(yīng)色素。將獲得的熒光標記外泌體樣品加入HeLa細胞培養(yǎng)上清中，經(jīng)過24小時的細胞吸收后，用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測。在熒光色素標記時預先向樣品中加入EV-Save，結(jié)果顯示，細胞內(nèi)的熒光信號比未添加EV-Save時大幅增強（圖1、A, B）。用PS Capture™ Exosome ELISA Kit后再比較凝膠過濾前后外泌體樣品的吸附損失， 未添加EV-Save的樣品在凝膠過濾后沒被檢測到外泌體表面標記物CD63的信號，而添加了EV-Save的樣品則檢測到了CD63的信號，所以，EV-Save能有效抑制凝膠過濾引起的吸附損失（圖1、C）。

圖1．熒光標記外泌體樣品的吸收確認與EV-Save抑制吸附損失的效果

用A公司的熒光標記試劑對MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分離的COLO201來源外泌體樣品（1 ×10¹⁰ particles）進行標記后，再用熒光顯微鏡（A）和流式細胞儀（B）確認HeLa細胞吸收外泌體樣品的情況。

準備同上的外泌體樣品（5 × 10⁹ particles），可以用PS Capture™ Exosome ELISA Kit比較CD63信號來檢測凝膠過濾前后的損失（C）。

通過FUJIFILM Wako PS親和法和超離法從相同量的培養(yǎng)上清樣品中分離、提取出外泌體樣品，再用A公司的熒光標記試劑標記外泌體樣品，進行細胞吸收外泌體的確認實驗（圖3）。熒光顯微鏡的分析結(jié)果表明，受體細胞吸收的由超離法分離、提取出的外泌體樣品比PS親和提取的外泌體樣品更多（圖3、A）。但是，詳細分析提取外泌體樣品時，盡管蛋白濃度和粒子數(shù)分析顯示出超離樣品含有更多的外泌體量，但是如果用PS Capture™ Exosome ELISA Kit檢測外泌體標記物CD63信號，PS親和法分離、提取的樣品比用超離法分離、提取的外泌體樣品的一個粒子的CD63信號和純度更高（圖3、B）。使用雜質(zhì)多、污染嚴重的超離法制備外泌體樣品時，受體細胞吸收的信號實體不僅來源于外泌體，也可能來源于雜質(zhì)蛋白。

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