免疫印跡（Western blot）檢測(cè)科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)介紹

時(shí)間：2024/9/26閱讀：25

免疫印跡（Western blot）檢測(cè)

應(yīng)用簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)免疫印跡法(WesternBlot)，簡(jiǎn)稱WB，是指通過(guò)SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開(kāi)，然后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到載體(PVDF)膜上，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，用特異性的一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，用HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗，再加以ECL發(fā)光液顯色，檢測(cè)組織或者細(xì)胞內(nèi)某種或者某些特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡是做蛋白質(zhì)分析的一種常規(guī)技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析，還可以用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。WB技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)研究領(lǐng)域。
技術(shù)原理
通過(guò)SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開(kāi)。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)（目前主要用HRP標(biāo)記的第二抗體），經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光，通過(guò)儀器或者膠片顯色）。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)方法

常見(jiàn)問(wèn)題
1、WB有什么優(yōu)點(diǎn)？
靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用ECL顯色法可達(dá)pg級(jí)。靈敏，相對(duì)便宜且特異性高。
2、細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
有沉淀可能因?yàn)榈鞍讻](méi)有變性晚全，可以適當(dāng)提高SDS的濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，一般需96℃以上10-15min左右；也不排除抗原濃度過(guò)高，這時(shí)需再加入適量上樣緩沖液。
3、膠片背景很臟，有什么解決方法？
減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r(shí)間和溫度(盡量4℃過(guò)夜，此孵育條件比37℃1h要溫和很多)，并提高封閉液濃度。
4、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)，同時(shí)顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象"。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新進(jìn)口的顯色底物。
5、電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：
①“︶"條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統(tǒng)溫度偏高，而且電場(chǎng)強(qiáng)度太大(電泳的電場(chǎng)大致呈現(xiàn)U形，所以因?yàn)橼s時(shí)間而加大電壓可能會(huì)出現(xiàn)這個(gè))。
②“︵"條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不晚全。
③條帶拖尾
原因：樣品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
④紋理(縱向條紋)
原因：樣品中含有不溶性顆粒，可能抽提蛋白時(shí)出了問(wèn)題。
⑤條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜，一定要子平面臺(tái)子上電泳，膠要做好。
⑥條帶兩邊擴(kuò)散
原因：加樣量過(guò)多，彌散至孔周圍了，減少上樣量或者使用5X上樣緩沖液。

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