在成人肌細(xì)胞收縮中的應(yīng)用

該系統(tǒng)被理想化和開(kāi)發(fā)以消除光學(xué)邊緣檢測(cè)和分割方法的局限性，例如在成人 CM 的采集過(guò)程中對(duì)適當(dāng)?shù)募?xì)胞對(duì)齊和細(xì)胞旋轉(zhuǎn)的要求（Delbridge 和 Roos，1997 年；Ren 和 Wold ， 2001年） . 為了測(cè)試我們方法的有效性和敏感性，我們將細(xì)胞暴露于對(duì)收縮參數(shù)有明確影響的藥物。成人 CM 接受異丙腎上腺素 (ISO) (100 nmol L -1 ) 或維拉帕米(VERA) (100 nmol L -1). 異丙腎上腺素是一種 β-腎上腺素能激動(dòng)劑，通過(guò)增加平均速度和縮短長(zhǎng)度的程度顯著增強(qiáng) CM 收縮力，從而減少收縮和松弛所需的時(shí)間（Butler 等人，2015 年；Harmer 等人，2012年）。維拉帕米是一種鈣通道阻滯劑，廣泛用于治療心律失常（Bourgonje 等人，2013 年），同時(shí)也是一種抗高血壓藥，因?yàn)樗谛呐K系統(tǒng)中具有負(fù)性肌力和變時(shí)作用（Harmer 等人，2012 年；斯特恩等人，1986 年）。圖 4Ai-ii 分別顯示了樣本空間圖像和平均速度軌跡，這些記錄是從以 1 Hz 刺激并用異丙腎上腺素或維拉帕米處理 60 秒的細(xì)胞記錄的。圖 4 Aiii 顯示了從一個(gè)收縮-松弛周期獲得的一條平均速度軌跡的放大視圖。圖 4 B–4D顯示了來(lái)自三個(gè)立實(shí)驗(yàn)的異丙腎上腺素和維拉帕米對(duì)成人 CM 收縮參數(shù)影響的濃度響應(yīng)分析。如圖4 B所示，ISO 和 VERA 都減少了收縮和松弛時(shí)間，對(duì)松弛時(shí)間的影響更顯著。此外，ISO 增加了大收縮和松弛速度（圖 4 C）并縮短了面積（圖 4D) 成人 CM 的濃度依賴性方式。當(dāng)用 VERA 處理細(xì)胞時(shí)，觀察到相反的效果（圖 4C和 4D）。表 S1列出了用不同濃度的 ISO 和 VERA 處理的成人 CM 獲得的所有收縮參數(shù)。值得注意的是，數(shù)據(jù)分析不需要用戶操作圖像，因?yàn)檐浖梢蕴幚韺?shí)驗(yàn)生成的整個(gè)圖像。

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圖 4。小鼠和 TGR-mREN2-27 大鼠成人 CM 收縮效應(yīng)的收縮波運(yùn)動(dòng)和圖形檢測(cè)

(A) (i) 在大收縮速度 (MCS) 和大松弛速度 (MRS) 響應(yīng)異丙腎上腺素 (100 nmol L ?1 ) 期間，成年小鼠 CM 細(xì)胞位移速度顯示在幅度和矢量場(chǎng)中，具有視覺(jué)和數(shù)字強(qiáng)度標(biāo)度檢測(cè)或維拉帕米（100 nmol L -1）治療。比例尺，20 微米。(ii) 從以 1 赫茲刺激收縮的 CM 記錄的平均速度圖。(iii) 在異丙腎上腺素或維拉帕米治療對(duì) CM 的影響下獲得了一個(gè)單一的收縮-松弛周期。

(B) 用 ISO 和 VERA 進(jìn)行急性處理會(huì)導(dǎo)致 CM 的所有時(shí)間參數(shù)顯著降低。

(C–E) (C) 用 VERA 處理的細(xì)胞表現(xiàn)出 MCS 和 MRS 的減少，而 ISO 誘導(dǎo)這些參數(shù)顯著增加。ISO 和 VERA 對(duì)縮短面積 (D) 和縮短分?jǐn)?shù) (E) 產(chǎn)生相反的影響。

(F) (i) 在 MCS 和 MRS 期間，SD 和 mREN 細(xì)胞位移速度顯示在幅度和矢量場(chǎng)中，具有視覺(jué)和數(shù)字強(qiáng)度尺度檢測(cè)。比例尺，20 微米。(ii) 在一個(gè)收縮-松弛周期中 SD 和 mREN 細(xì)胞的圖形比較。(iii)–(iv) SD 和 mREN CM 顯示相似的 MCS 和 MRS。(v)–(vi) 與 SD 相比，mREN 細(xì)胞的收縮和松弛時(shí)間有所增加。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞，我們分析了至少 10 個(gè)事件（每個(gè)事件對(duì)應(yīng)一個(gè)收縮-松弛周期），結(jié)果代表這些事件的平均值。結(jié)果表示為來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均 30 個(gè)細(xì)胞的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 與對(duì)照相比。

該系統(tǒng) 的另一個(gè)特點(diǎn)是可以獲取成人 CM 細(xì)胞長(zhǎng)度的縮短百分比。在 Motion Visualization 的窗口中（Advanced > Export cell length data— Methods S1：User Manual— section 7.4 Figure 70），用戶可以打開(kāi)一個(gè)新窗口來(lái)測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)度的縮短百分比（圖 S3）。該窗口顯示波選擇框，其中包含先前選擇的收縮-松弛波（圖 S3 A上的藍(lán)色條，左側(cè)）及其各自的圖形（圖 S3 A，右側(cè)）。該系統(tǒng) 使用細(xì)胞分割過(guò)程來(lái)獲取細(xì)胞邊界長(zhǎng)度并應(yīng)用過(guò)濾器來(lái)找到細(xì)胞的佳分割（圖 S3B). 數(shù)據(jù)可以可視化并實(shí)時(shí)繪制圖表（圖 S3 C）。然后，可以導(dǎo)出分析的波形數(shù)據(jù)。為了驗(yàn)證我們的分割方法，我們通過(guò)使用經(jīng)異丙腎上腺素和維拉帕米處理或未處理的成人 CM 進(jìn)行了縮短細(xì)胞長(zhǎng)度百分比分析。如圖 4 E所示，ISO 增加了成人 CM 細(xì)胞長(zhǎng)度的縮短百分比，而 VERA 減少了它。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，該系統(tǒng) 可以可靠、高效地處理和分析來(lái)自成人 CM 的數(shù)據(jù)，檢測(cè)藥物作用下收縮參數(shù)的差異。例如，這種敏感性允許研究可能具有心臟保護(hù)作用的藥物，以及與現(xiàn)有心臟病相關(guān)的變化。

該系統(tǒng) 在大鼠高血壓模型中的適用性

收縮力缺陷是高血壓動(dòng)物模型的一個(gè)共同特征（Jesus 等人，2020 年；Kovács 等人，2016 年）。在這里，我們使用了一種充分表征的高血壓大鼠模型，該模型由腎外組織中腎素的基因過(guò)度表達(dá)引起，即 TGR (mREN2)27 大鼠（Langheinrich，1996 年；Mullins 等人，1990 年）。mREN CM 的一個(gè)重要特征是細(xì)胞面積增加，這是心肌肥大的特征（Jesus 等人，2020 年）). 鑒于 該系統(tǒng) 獲取幅度速度的平均值，比較的單元格之間的大小差異越大，獲取可能存在的差異的靈敏度就越低。因此，與 Sprague-Dawley (SD) 大鼠肌細(xì)胞相比，測(cè)量肥大 mREN 肌細(xì)胞的數(shù)據(jù)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。為了避免這個(gè)問(wèn)題，我們通過(guò)使用新的過(guò)濾器（幅度閾值）實(shí)現(xiàn)了一個(gè)管道（有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參見(jiàn)方法 S1：用戶手冊(cè)—— 7.3 節(jié)，幅度閾值過(guò)濾器）。

圖 4 Fi–ii 顯示了帶有運(yùn)動(dòng)矢量的 CM 圖像以及 SD 和 mREN 肌細(xì)胞的平均速度軌跡的比較。如圖 4 Fiii–iv所示，SD 和 mREN 肌細(xì)胞之間的大收縮或舒張速度沒(méi)有差異。另一方面，與 SD 細(xì)胞相比，該系統(tǒng) 檢測(cè)到 mREN 肌細(xì)胞的收縮和舒張時(shí)間顯著增加（圖 4 Fv-vi）。收縮參數(shù)詳見(jiàn)表S2。這些結(jié)果通過(guò)更詳細(xì)地顯示通過(guò)矢量場(chǎng)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及整個(gè)細(xì)胞，擴(kuò)展了先前的發(fā)現(xiàn)（ Jesus 等人，2020 年）。

新生兒 CM 培養(yǎng)和 hiPSC-CM 中的 該系統(tǒng) 驗(yàn)證

來(lái)自不同發(fā)育階段的心肌細(xì)胞顯示出功能和結(jié)構(gòu)差異。該系統(tǒng) 旨在獲取 CM 在不同成熟和細(xì)胞發(fā)育階段的多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的收縮參數(shù)。hiPSC-CM 和新生兒-CM 是未成熟細(xì)胞，與成年心室肌細(xì)胞相比表現(xiàn)出明顯的形態(tài)和結(jié)構(gòu)組織特征（Bedada 等人，2016 年；Khan 等人，2015 年；Li 等人，2017 年；Rohr 等人， 1991). 這種結(jié)構(gòu)上的不成熟會(huì)影響 CM 的收縮性，它比成人 CM 的強(qiáng)度要低得多，并對(duì)其采集和分析提出了挑戰(zhàn)。此外，hiPSC-CM 和新生兒 CM 會(huì)自組織成合胞體并表現(xiàn)出自發(fā)收縮（Bedada 等人，2016 年；Li 等人，2017 年）。

HiPSC-CM 已通過(guò)不同的技術(shù)進(jìn)行探索，以獲得收縮和松弛的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)（Czirok 等人，2017 年；Huebsch 等人，2015 年；Maddah 等人，2015 年；Pointon 等人，2017 年）。然而，它們?cè)谘芯亢团R床中心作為常規(guī)應(yīng)用仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，要么是由于實(shí)施困難，要么是因?yàn)槿匀蝗鄙倬哂袕?qiáng)大處理能力的工具以及為非專業(yè)觀眾設(shè)計(jì)的界面。該系統(tǒng) 提供了一種可靠、快速且易于訪問(wèn)的方法來(lái)處理和分析這些細(xì)胞類型的收縮動(dòng)力學(xué)，從圖像到終結(jié)果集。

使用 該系統(tǒng)，我們確定了 hiPSC-CM（圖 5和S4）和新生兒 CM（圖 6 ）在基礎(chǔ)控制條件下以及與 ISO 和 VERA 孵育后的收縮和松弛周期的平均速度。圖 5 A 顯示了檢測(cè)所有 hiPSC-CM 合胞體運(yùn)動(dòng)的示例空間圖像，它允許用戶從多個(gè)收縮-松弛周期中提取平均速度軌跡（圖 5 B）。為了在單波水平上更好地了解 ISO 和 VERA 治療，圖 5繪制了每個(gè)特定波的圖表C. ISO 和 VERA 對(duì) hiPSC-CM 的影響也以濃度依賴的方式發(fā)生，并且在速度依賴參數(shù)（圖 S4 A）和平均縮短面積（圖 S4 B）上顯示出相反的結(jié)果，正如我們對(duì)這些藥物的預(yù)期. 正如先前在文獻(xiàn)中報(bào)道的那樣（Hayakawa 等人，2014 年），在使用 ISO 和 VERA 治療后觀察到收縮和舒張時(shí)間的相當(dāng)減少（圖 S4 C）。此外，ISO 和 VERA 增加了 hiPSC-CM 的跳動(dòng)頻率（圖 S4 D）?？偠灾?，這些結(jié)果證實(shí)了我們系統(tǒng)的多功能性，為用戶提供了獲得視覺(jué)和定量評(píng)估的可能性通過(guò)微妙的修改不同的收縮細(xì)胞類型。

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圖 5。異丙腎上腺素和維拉帕米在 hiPSC-CM 收縮力中的收縮波運(yùn)動(dòng)和圖形檢測(cè)

(A) 從用異丙腎上腺素 (100 nmol L -1 ) 或維拉帕米 (100 nmol L -1 ) 處理的細(xì)胞獲得的視覺(jué)和數(shù)值強(qiáng)度標(biāo)度檢測(cè)中的 hiPSC-CM 大位移速度。比例尺，50 微米。

(B) 異丙腎上腺素或維拉帕米治療平均速度的圖形檢測(cè)。

(C) 比較一個(gè)收縮-松弛周期中藥物引起的變化。MCS，大收縮速度；MRS，大弛豫速度。另請(qǐng)參見(jiàn)圖S4。

同樣，圖 6 A 顯示該系統(tǒng)通過(guò)膜位移和運(yùn)動(dòng)矢量的生成，有效檢測(cè) ISO 和 VERA 新生兒 CM 治療組的細(xì)胞收縮力差異（圖 6 Ai-iii ）。此外，分析表明，ISO 和 VERA 均以濃度依賴性方式顯著減少新生兒 CM 的收縮和松弛時(shí)間（圖6 B）。正如對(duì)這些藥物所預(yù)期的那樣，用 ISO 治療會(huì)導(dǎo)致速度相關(guān)參數(shù)（圖 6 C）和 CM 縮短區(qū)域（圖 6D)，而 VERA 處理的細(xì)胞觀察到減少。此外，該系統(tǒng)檢測(cè)了接受藥物治療或未接受藥物治療的新生兒 CM 的自律。在分析新生兒 CM 的搏動(dòng)頻率時(shí)，也觀察到 ISO 和 VERA 的相反結(jié)果（圖 6 E）。hiPSC-CM 和新生兒-CM 在用不同濃度的藥物治療后的收縮參數(shù)分別列于表 S3和S4中。

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圖 6。異丙腎上腺素和維拉帕米對(duì)新生兒 CM 收縮力影響的收縮波運(yùn)動(dòng)和圖形檢測(cè)

(A) (i) 在從異丙腎上腺素 (100 nmol L ?1 ) 或維拉帕米 (100 nmol/L ?1 ) 治療的作用獲得的收縮-松弛周期期間，新生兒 CM 細(xì)胞在視覺(jué)和數(shù)值強(qiáng)度尺度檢測(cè)中的位移速度。比例尺，50 微米。(ii) 從異丙腎上腺素或維拉帕米治療的新生兒 CM 記錄的平均速度修改的圖形檢測(cè)。(iii) 比較一個(gè)收縮-松弛周期中藥物引起的變化。

(B) 用 ISO 和 VERA 進(jìn)行急性治療可顯著降低新生兒 CM 的收縮和舒張時(shí)間參數(shù)。

(C) 用 VERA 處理的細(xì)胞表現(xiàn)出 MCS 和 MRS 減少，而 ISO 誘導(dǎo)這些參數(shù)顯著增加。

(D) 同樣，ISO 和 VERA 對(duì)縮短區(qū)域產(chǎn)生相反的影響。

(E) 兩種處理對(duì)細(xì)胞跳動(dòng)濃度-反應(yīng)曲線顯示出相反的效果。從每個(gè)細(xì)胞區(qū)域，我們分析了至少 10 個(gè)事件（每個(gè)事件對(duì)應(yīng)于收縮-松弛周期），結(jié)果代表這些事件在 ISO 和 VERA 存在或不存在的情況下的平均值。結(jié)果表示為來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的 20 個(gè)細(xì)胞區(qū)域的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 與對(duì)照相比。

為了總結(jié)我們的發(fā)現(xiàn)，表 S5比較了收縮和松弛速度的大倍數(shù)變化，以及用 ISO 或 VERA 處理的成人 CM、新生兒 CM 和 hiPSC-CM 之間的縮短面積參數(shù)。如表S5所示，與成人 CM 和新生兒 CM 相比，hiPSC-CM 在收縮和松弛速度大倍數(shù)變化方面對(duì) ISO 的響應(yīng)較弱。這一發(fā)現(xiàn)表明，與 hiPSC-CM 相比，新生細(xì)胞的 β-腎上腺素能反應(yīng)有所改善，并表明這兩種細(xì)胞類型之間的成熟度存在差異。盡管成人 CM 和新生兒 CM 具有相似的大倍數(shù)變化值，但前者表現(xiàn)出較低的半數(shù)大有效濃度，證實(shí)了這些細(xì)胞對(duì) ISO 的反應(yīng)更強(qiáng)。這與以下事實(shí)一致：與成人 CM 相比，hiPSC-CM 和新生兒 CM 呈現(xiàn)不成熟的 β-腎上腺素能受體信號(hào)（Jung 等人，2016 年；Slotkin 等人，1995 年）). 然而，與成人 CM 相比，新生兒 CM 和 hiPSC-CM 對(duì) VERA 的反應(yīng)更強(qiáng)，在新生兒細(xì)胞中觀察到更明顯的抑制收縮作用。同樣，與成人 CM 相比，新生兒 CM 和 hiPSC-CM 顯示 MCS 對(duì) VERA 的半數(shù)大抑制濃度降低。這些差異至少部分反映了未成熟細(xì)胞對(duì)肌膜 Ca 2+循環(huán)的高度依賴性和未成熟 Ca 2+釋放單元的存在（ Korhonen 等人，2009 年；Louch 等人，2015 年）。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)增強(qiáng)了我們軟件檢測(cè)細(xì)胞對(duì)不同藥物的收縮反應(yīng)差異的敏感性。