產(chǎn)品貨號(hào)：AV1501—A

產(chǎn)品名稱：人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒

Human urine- -derived mesenchymal stem cell isolation kit

人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒產(chǎn)品描述：

該試劑盒為經(jīng)過(guò)優(yōu)化的低血清（2%V/V）尿源間充質(zhì)干細(xì)胞（Urine-derived mesenchymal stem

cell, USC）分離培養(yǎng)基。用于選擇性篩選泌尿系統(tǒng)來(lái)源的尿源間充質(zhì)干細(xì)胞。低血清和選擇性生長(zhǎng)因子、激素的聯(lián)合應(yīng)用確保尿源干細(xì)胞在體外環(huán)境下的原代篩選和旺盛的增殖活力，配合人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒可在短時(shí)間內(nèi)收獲大量細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：

·配好后避光2-8℃保存， 4周內(nèi)使用完畢

·所有產(chǎn)品請(qǐng)于保質(zhì)期內(nèi)使用， 超過(guò)保質(zhì)期， 必須放棄使用

·為確保產(chǎn)品質(zhì)量，請(qǐng)避免反復(fù)凍融相關(guān)產(chǎn)品

尿源間充質(zhì)干細(xì)胞(USC)原代提取

1、準(zhǔn)備工作：

明膠包被：取適量0.1%明膠包被6孔板， 蓋過(guò)孔底即可，鋪平，放置37屯培養(yǎng)箱30分鐘以上，備用

注意事項(xiàng)：

．包被明膠的培養(yǎng)皿在無(wú)茼和明膠不蒸干的條件下，可以在4℃保存兩周。

2、尿液收集：

T75培養(yǎng)瓶或無(wú)茼取尿瓶表面噴75%酒精消毒，受試者戴無(wú)菌手套， 進(jìn)行200ML或以上尿液收集

注意事項(xiàng):

●收集尿液之前需對(duì)尿道外口進(jìn)行消毒:男性尿道外口噴75%酒精;女性用75%酒精濕巾擦拭尿道外口3次

●避免晨尿，盡量留取清潔中段尿

●注意無(wú)菌操作，勿觸摸瓶口，留取完畢后盡快封閉培養(yǎng)瓶拿至無(wú)菌操作間進(jìn)行后續(xù)操作，室外放置

時(shí)間不宜過(guò)久

3、原代提取:

1) 75%酒精消毒尿瓶外表面，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用移液槍將尿液分裝至50ml無(wú)菌離心管(4管左右)

2) 1500rpm，10min離心

3)取出明膠包被的六孔板，棄除多余明膠，放置工作臺(tái)風(fēng)干備用

4)離心完畢，棄尿上清，每管保留細(xì)胞沉淀不超過(guò)1ml

5)其中一管加入20ml PBS， 吹打混勻細(xì)胞沉淀

6)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一支離心管，吹打混勻，如此反復(fù)，直至將所有細(xì)胞沉渣懸液匯集于后一支離心管

7) 1500rpm，10min 離心

8)棄上清，12ml USC分離培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉渣，2ml/孔接種至六孔板， 記為P0-day1 (原代第1天)

9)此時(shí)光鏡下可見大量漂浮尿源多邊形角質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)皿放置379C培養(yǎng)箱

10)第2天，觀察是否有污染情況(細(xì)菌污染:培養(yǎng)基渾濁變黃,鏡下可見細(xì)沙狀細(xì)菌)

11)第3或4天，每孔加1ml USC分離培養(yǎng)基

12)第5或6天半量換液(棄1ml，加1ml USC分離培養(yǎng)基)

13)第8天左右，光鏡下可觀察米粒樣USC原代克隆形成

14)待克隆形成的形態(tài)稍大(第10天左右)，克隆形成孔進(jìn)行全換液，即棄漂浮細(xì)胞，PBS清洗，添加

2mlUSC分離*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

15)待大片密集克隆細(xì)胞形成(第12天左右，融合度達(dá)90%以上)，0.25% EDTA- -胰酶消化(尤其細(xì)胞克隆密集的地方) , USC分離*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞量傳至6孔板或10cm培養(yǎng)皿，記為P1代。

16)細(xì)胞隔天換液，待P1代細(xì)胞融合率達(dá)90%左右，0.25% EDTA-胰酶消化，換用USC擴(kuò)增*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1: 4比例傳代，進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

注意事項(xiàng):

●一般正常人尿液中的細(xì)胞沉淀有時(shí)較少，離心后管底不易觀察到，操作盡量輕柔，避免誤吸

●一般正常人200ml尿量可出3~5克隆，較少情況下無(wú)克隆產(chǎn)生，與供者身體素質(zhì)和時(shí)間有關(guān)

●USC細(xì)胞生長(zhǎng)較快，待克隆集簇融合成大片，或內(nèi)部生長(zhǎng)空間較小時(shí)即可進(jìn)行消化傳代

●原代細(xì)胞培養(yǎng)一般不超過(guò)14天，若14天尚無(wú)克隆產(chǎn)生，可棄

●為獲得活力旺盛的原代尿源干細(xì)胞，原代(P0)與P1代均需用USC分離*培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性篩選，P2代開始換用USC分離*培養(yǎng)基

本尿源間充質(zhì)干細(xì)胞分離*培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)原代尿液分離培養(yǎng)性能測(cè)試，詳見附圖(1, 2)

質(zhì)量控制

√無(wú)菌檢測(cè)(細(xì)菌、真菌和支原體檢測(cè))

√ pH測(cè)試

√滲透壓檢測(cè)

√內(nèi)毒素檢測(cè)

圖一

附圖1人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞原代提取流程圖

附圖2人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞原代提取、克隆形成圖片(光鏡: 100X )

day5~9可見米粒樣集簇細(xì)胞克隆形成，day10~14細(xì) 胞克隆融合成大片可進(jìn)行消化傳P1代