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類器官模型：未來已來，將至已至，遠方不遠
前 言
獲批IND的候選藥物在臨床前動物模型上表現(xiàn)出很好的藥效結(jié)果和安全性，但在人體的有效性和安全率卻不到10%。導致該結(jié)果的原因包括：種屬之間的差異、動物模型選擇的準確性、動物藥效實驗的科學性、客觀性和準確性等。
相較于細胞系（celllines）、基因工程鼠（genetically engineered mouse models, GEMMs）和人源化異種移植鼠（patient-derived xenografts, PDX）這些傳統(tǒng)的研究模型，類器官模型（鼠源類器官mouse-derived organoids, MDO）和人源類器官patient-derived organoids,PDO）不但能夠取自正常組織和組織癌變過程中各個階段的腫瘤組織，而且其培養(yǎng)體系簡單易操作，時間和金錢成本較低，且具有較高效率，因而得到廣大研究人員的青睞，被Nature Methods評為2017年生命科學領(lǐng)域年度技術(shù)。
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類器官研究領(lǐng)域
自2009年Hans Clevers教授報道了地一例類器官，共有11983篇關(guān)于類器官的研究論文發(fā)表（數(shù)據(jù)來源于PubMed），研究領(lǐng)域主要涉及腫瘤學和生物學，近4年來（2018-2022年），共發(fā)表10441篇論文發(fā)表，占整體發(fā)文量的87.1%。作為類器官領(lǐng)域的“獨角獸"Hans Clevers，共有263篇論文發(fā)表，部分論文發(fā)表在Nature、Cell等期刊。
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類器官簡介
類器官（organoid）：體外三維（3D）培養(yǎng)成體干細胞或多能干細胞的技術(shù)被稱之為“類器官"（Organoids）技術(shù)，所培養(yǎng)的組織類似物具有一定空間結(jié)構(gòu)，并能模擬真實器官部分功能。主要來源于胚胎干細胞、多功能誘導干細胞、成體干細胞及腫瘤干細胞。
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類器官培養(yǎng)及構(gòu)建
類器官培養(yǎng)方式主要分為2類：浸潤式培養(yǎng)和氣液交界培養(yǎng)。
類器官的構(gòu)建就像是在調(diào)制一杯“雞尾酒"。其主要原理是基于干細胞和發(fā)育生物學原理，根據(jù)胚胎發(fā)育和器官發(fā)生線索，模擬自然發(fā)育過程而分化形成特定譜系的微小器官。與傳統(tǒng)模型相比：蕞大程度模擬體內(nèi)相應組織器官的空間結(jié)構(gòu)和生理功能，而提供與人體高度一致的生理/病理系統(tǒng)。
以小腸類器官為例，2007年，Hans Clevers實驗室就通過lineage tracing實驗（細胞譜系示蹤技術(shù)）發(fā)現(xiàn)小腸和結(jié)腸的干細胞為Lgr5+細胞。2009年，荷蘭科學家Hans Clevers的團隊成功地在體外將Lgr5+腸道干細胞培養(yǎng)成包括隱窩樣區(qū)域和絨毛樣上皮區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)，即小腸類器官。這一結(jié)構(gòu)包含所有終末分化細胞類型，能準確模擬腸道上皮生理情況，這一方法的建立既實現(xiàn)了腸上皮長期體外培養(yǎng)又可以維持腸上皮細胞原始分化能力，該技術(shù)已經(jīng)逐漸被應用于干細胞、疾病模型以及再生藥物等相關(guān)研究。小腸類器官的培養(yǎng)可以通過多能誘導干細胞或胚胎干細胞來誘導分化，也可以取小腸的隱窩干細胞來誘導分化。目前大多數(shù)研究都是采用小腸隱窩干細胞來培養(yǎng)，因為該方法不僅獲取干細胞方便，對技術(shù)的要求不高，而且培養(yǎng)的類器官傳代次數(shù)更多，可以在體外長期培養(yǎng)長達2個月之久。具體培養(yǎng)方式見ppt原文。
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類器官種類
類器官培養(yǎng)已應用于各種器官，包括：大腦（brain）、視杯（Optic Cup）、內(nèi)耳（Inner Ear）、肺(lung)、肝(liver)、結(jié)腸（Colon）、腎（Kidney）、胰腺(Pancreatic)、前列腺(Prostate)、胃（Gastroids）、乳腺（galactophore），2023年1月，Hans Clevers團隊構(gòu)建出非酒精性脂肪肝類器官模型，工程人肝細胞類器官使基于CRISPR的靶點發(fā)現(xiàn)和藥物篩選成為可能。
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類器官應用
類器官應用領(lǐng)域廣闊：類器官作為體外模型，在疾病發(fā)生機理、新靶點發(fā)現(xiàn)、診療新策略探索、藥敏檢測、新藥研發(fā)、再生醫(yī)學等多方向擁有廣泛的應用前景。其中肝類器官已被應用于藥物療效毒性以及輔助患者建立個體化治療方案等。我們以“利用肝臟類器官預測藥物誘導的磷脂質(zhì)病"為例，介紹類器官的應用。
PL誘導劑：阿米卡星、鹽酸胺碘酮、鹽酸舍曲林和對乙酰氨基酚。阿米卡星、胺碘酮和舍曲林分別是弱、中度和強的PL誘導藥物。對乙酰氨基酚作為誘導PL的陰性對照藥物。
類器官培養(yǎng)：單個患者的人肝組織（0.5-1cm3）從首爾峨山醫(yī)療中心進行的肝切除術(shù)中獲得。手術(shù)切除后，組織在漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）中保持在4℃，直到處理。參考前期文獻：組織用無菌剪刀切碎，用膠原酶D和Dnase I在無菌Earle平衡鹽溶液（EBSS）培養(yǎng)基中中消化。將分離的導管細胞與基質(zhì)凝膠或還原生長因子BME 2（基底膜提取物）混合，每孔5000-10000個細胞接種于24孔板中?；|(zhì)凝膠或BME固化后，每孔加入500µL培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12，并包括各種補充劑。前3天，培養(yǎng)基中添加25 ng/mL重組人肝素、100 ng/mL Wnt3a和10µM Y27632分離導管細胞。然后用不含Noggin、Wnt3a或Y27632代替。在單個導管細胞變成一個類器官后，每5-7天以1：2-1：4的分裂比例進行傳代。在37℃的含有5%二氧化碳的潮濕氣氛中培養(yǎng)。
肝標志物表達：類器官與HepG2表達水平相當。采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測CYP3A4和白蛋白基因的表達情況。從人肝組織中提取的RNA作為陽性對照。CYP3A4在類器官細胞中的mRNA表達水平略高于HepG2細胞（圖a）。類器官細胞和HepG2細胞之間的白蛋白mRNA表達水平相當（圖b）。肝組織中CYP3A4和白蛋白的mRNA表達水平明顯高于類器官和HepG2培養(yǎng)系統(tǒng)。
糖原積累：采用PAS染色法檢測人肝類器官、HepG2細胞和人肝組織中糖原的積累情況。類器官呈明顯的陽性糖原染色，呈強烈的洋紅色。HepG2細胞的染色不如類器官細胞清晰。類器官細胞的細胞質(zhì)中含有多糖或糖原、糖蛋白、糖脂等多糖或粘液物質(zhì)，如圖所示。
蛋白表達：肝臟轉(zhuǎn)錄因子HNF4α在類器官中表達比HepG2強很多。用免疫熒光法在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中均可檢測到肝蛋白HNF4α。如圖a-c所示，人肝類器官蛋白呈陽性（綠色），強于HepG2細胞。在HepG2細胞的胞漿中呈非特異性陽性染色。通過免疫組化方法觀察了兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中CYP3A4和CYP1A2的表達。如圖d-f所示，CYP3A4在人肝類器官中的表達比在HepG2細胞中更明顯。CYP1A2在兩種肝細胞培養(yǎng)中均明顯表達陽性（圖g-i）。
細胞活力測試：在培養(yǎng)48小時后，當暴露于高劑量的PL誘導藥物時，人肝臟類器官比HepG2細胞存活得更好。各PL藥物組的類器官和HepG2細胞的活力均發(fā)生了顯著變化。2D和3D培養(yǎng)的肝細胞均暴露于舍曲林。在20µM劑量的胺碘酮和舍曲林作用下，HepG2細胞的單層細胞顯示出明顯的細胞死亡，而在這些藥物濃度下，類器官的活性更高。對乙酰氨基酚在25µM或50µM水平下使用，在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中均未引起顯著的細胞活力變化。
白蛋白分泌水平：在PL誘導藥物存在的情況下，HepG2細胞的白蛋白分泌水平比肝類器官更明顯地下降（取決于其PL誘導潛能的強度）。兩種肝細胞培養(yǎng)系統(tǒng)均與10µM PL誘導藥物或25µM對乙酰氨基酚作為陰性對照孵育48 h。與HepG2細胞相比，類器官細胞保持了更穩(wěn)定的白蛋白分泌能力。
形態(tài)學變化：為了評估PL導致的類器官和HepG2細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的形態(tài)學變化，細胞用10µM的指示藥物或25µM的對乙酰氨基酚處理48小時，H&E染色。如圖所示，在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中，具有較高的PL誘導能力的藥物均可導致較高的細胞質(zhì)液泡量。雖然這些液泡變化認為是藥物誘導的PL的結(jié)果，但這些由這種情況引起的空泡化實體類似于光鏡下組織載玻片處理過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)積累或偽影。
LAMP-2表達比較：LAMP-2免疫組化染色檢測磷脂積累（圖）。將細胞與10µM的PL誘導藥物（阿米卡星、胺碘酮或舍曲林）或25µM的對乙酰氨基酚孵育48小時。在相同條件下，與HepG2細胞相比，類器官細胞在細胞質(zhì)中具有更明顯的LAMP-2陽性染色。舍曲林處理組的兩種細胞的細胞質(zhì)染色陽性zui強。
PL證實：用透射電鏡證實了藥物誘導的肝臟類器官磷脂病（圖）。10µM胺碘酮處理48h后，類器官產(chǎn)生明顯的層狀體。
基因表達（LSS和P8 mRNA）的變化：LSS和P8為PL生物標記物。為了評估藥物誘導的PL的嚴重程度，采用qPCR方法檢測了特異性基因標記物的變化值。兩種培養(yǎng)體系中的細胞分別用胺碘酮（5µM，10µM）或舍曲林（5µM，10µM）處理48小時。研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞對10µM舍曲林毒性非常敏感，因此在這種條件下不可能提取RNA。如圖所示，類器官的LSS和P8 mRNA表達水平均有上調(diào)。
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類器官面臨的挑戰(zhàn)
成本：類器官作為新型的藥篩模型，成本雖然較PDX更低，但還是高于細胞系。類器官成本占比較高的包括培養(yǎng)使用的基質(zhì)膠。
目前大多類器官本身并不具備血管化的結(jié)構(gòu)。因此，隨著類器官體積的增長，類器官受限于氧氣的缺失以及代謝廢物的增加，可能導致的組織壞死。已有研究構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞微環(huán)境的腫瘤類器官，將類器官腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞在Matrigel上共同培養(yǎng)，生成血管結(jié)構(gòu)以期解決類器官血管化缺失的問題。
血管化以外的難點還包括模擬腫瘤和免疫環(huán)境的相互作用關(guān)系。2019年Nature Protocol期刊發(fā)表了腫瘤類器官和免疫細胞共同培養(yǎng)的相關(guān)protocol，可以體現(xiàn)和模擬出腫瘤微環(huán)境的部分特征。以上皮類器官和免疫細胞共培養(yǎng)模型為例，可通過在培養(yǎng)基中添加活化的免疫細胞、在組織消化成單細胞后和免疫細胞共同生長、添加ECM中的重組細胞因子等方法重塑類器官和免疫細胞的相互作用。
相比于單個類器官，類器官系統(tǒng)的構(gòu)建能夠?qū)λ幬锆熜Ш蜐撛诙拘宰龀龈暾娴脑u估。目前類器官僅能檢測出藥物對于腫瘤的抑制效果，對于其他器官組織是否存在其他副作用和安全性風險并不能做出預判。
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