中文說明書                                                UNIONHONEST

本品僅供研究使用                酶聯(lián)免疫吸附測試  Enzyme linked lmmunosorbent Assay

                    小鼠甲胎蛋白(AFP)ELISA檢測試劑盒

用    途： 用于小鼠血清、血漿及相關液體樣本中甲胎蛋白(AFP)的測定。

檢測原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中小鼠甲胎蛋白(AFP)的水平。向預先包被了小鼠甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體的酶標孔中加入甲胎蛋白(AFP)，溫育；溫育后，加入生物素標記的甲胎蛋白(AFP)抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠甲胎蛋白(AFP)的濃度呈正相關。

試劑盒組成 

需要而未提供的試劑和器材

• 酶標儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片) 。
• 洗板機（可調注液量，保證每孔洗液加至0.35ml而不溢出）。
• 超凈工作臺，生物安全柜，通風柜。
• 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
• 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).
• 37℃恒溫箱。
• 低溫離心機。
• 電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.

9.  漩渦混合儀，低頻振蕩器等

注意事項

• 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
• 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。
• 為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
• 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
• 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

6.   所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時必須注意安全。

7.  各步驟加樣均應使用加樣器，并經常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

8.  每次試驗測定的同時做標準曲線，。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔zui高濃度的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。

9.  配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內的試劑，充分混勻對測試結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻。

10.  實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預熱。

11.  手工洗板應注意：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存或根據(jù)存放，時間做相應溫度調整，但應避免反復凍融，（由于樣本種類過多，每個單位處理方式不一樣，本說明書不做詳細介紹）。

操作程序

• 標準品的稀釋：（本試劑系統(tǒng)提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）按下表格執(zhí)行：

• 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
• 加樣：1）空白孔：（空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗甲胎蛋白(AFP)抗體，鏈霉親和素-HRP，其余各步操作相同 ；2）標準品孔:加入標準品50μl，鏈霉親和素-HRP50μl（標準品中已事先整合好生物素標記抗體，故在操作時不加，只加鏈霉素-HRP）；3）樣本反應孔：加入樣本40μl，然后各加入抗甲胎蛋白(AFP)抗體10μl、鏈霉親和素-HRP（空白孔除外）50μl。蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
• 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋備用。
• 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
• 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
• 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
• 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。

結果判斷

1.  每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。（若不減零孔值，標準曲線的零孔應相交于Y軸） 

2. 根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種熟悉應用軟件來計算。

3．手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析計算結果。

4．若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9200。
2.  靈敏度：zui小可檢測濃度達，0.195ng/ml。
3.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4.  重復性：板內、板間變異系數(shù)均小于15%。

5 . 回收率：70-110%.

6. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

7. 有效期：6個月

8. 檢測范圍： 80ng/ml -0.78ng/ml