由于具有高速度、高分離效果、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，HPLC的應(yīng)用發(fā)展非常神速。目前，幾乎所有需要分離的大分子有機(jī)物分析工作，它都可以發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。可以預(yù)言，HPLC儀器的應(yīng)用，將在“農(nóng)、輕、重、海、陸、空，吃、穿、用”等各個(gè)領(lǐng)域、各行各業(yè)*、無(wú)所不有。
但是，如何用好HPLC是一個(gè)非常關(guān)鍵的問(wèn)題?；谧髡叩拈L(zhǎng)期實(shí)踐，以下從儀器學(xué)理論、分析誤差理論、分析化學(xué)等多個(gè)角度來(lái)全面討論。

1、泵、柱、檢測(cè)器三者的關(guān)系的認(rèn)識(shí)和目前使用者普遍存在的問(wèn)題

　　目前很多研發(fā)、使用HPLC的科技工作者，沒(méi)有搞清楚或沒(méi)有*搞清楚HPLC中的泵、柱、檢測(cè)器三者的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外很多生產(chǎn)廠商只是生產(chǎn)泵、檢測(cè)器，色譜柱子都是外購(gòu)件。我們說(shuō)HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，是指泵、柱、檢測(cè)器三者組成的一個(gè)完整的系統(tǒng)。如果只生產(chǎn)泵、檢測(cè)器，就不能說(shuō)是生產(chǎn)完整的HPLC儀器，只是生產(chǎn)了HPLC的兩種部件，再買(mǎi)一根色譜柱組裝成一臺(tái)儀器后出售。所以，這樣生產(chǎn)的HPLC系統(tǒng)，到了用戶(hù)那里，總是不好用或者不大好用。而廣大使用者，由于沒(méi)有將HPLC的泵、柱、檢測(cè)器三者互相影響的關(guān)系搞清楚，所以不能將HPLC用到 jia水平(得到誤差小的 jia分析檢測(cè)數(shù)據(jù))。以本人長(zhǎng)期的研發(fā)和使用HPLC的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為研發(fā)、使用HPLC時(shí)，以下問(wèn)題特別值得注重：

　　正確認(rèn)識(shí)、處理HPLC的泵、柱、檢測(cè)器三者的關(guān)系：

　　(1) HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，必須將泵、柱、檢測(cè)器三者(三個(gè)部件)結(jié)合起來(lái)才能叫HPLC。三者都合格，聯(lián)機(jī)后的整機(jī)系統(tǒng)才有可能合格，但不能肯定系統(tǒng)就會(huì)合格。只有泵、柱、檢測(cè)器三者質(zhì)量都合格，并且聯(lián)機(jī)后檢測(cè)結(jié)果也合格，才能說(shuō)明這臺(tái)HPLC是合格的。

　　(2) 三個(gè)部件都重要，不能偏重哪一方面。三者誰(shuí)是核心?誰(shuí)重要?目前，光譜、色譜工作者對(duì)此看法都各不相同、各有表述，我們不必去追究這些。作者認(rèn)為應(yīng)該說(shuō)三者是一個(gè)整體，缺一不可，都很重要。

　　(3)本人長(zhǎng)期使用過(guò)HPLC，也研發(fā)過(guò)HPLC儀器，實(shí)踐使本人深深認(rèn)識(shí)到：必須將三個(gè)部件聯(lián)接起來(lái)檢驗(yàn)測(cè)試，并能達(dá)到質(zhì)量指標(biāo)要求，才能說(shuō)這臺(tái)HPLC達(dá)到了質(zhì)量要求。否則，只能說(shuō)是部件合格，而整機(jī)系統(tǒng)不一 定能合格。為什么? 因?yàn)椋?/p>

　　①泵會(huì)因?yàn)橹訂?wèn)題產(chǎn)生壓力不穩(wěn)、流量不穩(wěn)定，會(huì)影響HPLC系統(tǒng)的質(zhì)量;

　?、谥鶎?duì)泵影響很大：柱堵塞、柱沾污、柱接頭漏液等，都會(huì)影響泵的壓力波動(dòng)、使流速不穩(wěn)定，會(huì)影響系統(tǒng)不穩(wěn)，使RSD變壞、峰拖尾、靈敏度降低;

　?、壑鶎?duì)檢測(cè)器影響很大：柱效降低(柱塔板數(shù)降低)、柱堵塞、柱的新舊程度、接頭、管道漏液等，都會(huì)影響檢測(cè)器的檢測(cè)限、分辨率、噪聲、和靈敏度。

　　請(qǐng)注意：色譜柱是易損件，用戶(hù)會(huì)經(jīng)常在色譜柱長(zhǎng)時(shí)間使用后換新柱，此時(shí)HPLC系統(tǒng)的泵和檢測(cè)器基本進(jìn)入“電子元件失效理論”的盆底，比較穩(wěn)定了。所以，不會(huì)因?yàn)閾Q新柱而產(chǎn)生儀器不能使用的問(wèn)題。特別應(yīng)該指出的是：用戶(hù)換新柱后，一般不檢測(cè)系統(tǒng)的綜合指標(biāo)。如果檢測(cè)指標(biāo)，可能就不能達(dá)到原出廠指標(biāo)(因?yàn)楸煤蜋z測(cè)器經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)期使用后，質(zhì)量會(huì)有所下降，舊泵、新柱、舊檢測(cè)器三者不能達(dá)到 jia配備)，但是不會(huì)影響使用。

　　用戶(hù)換新柱不會(huì)影響使用的問(wèn)題，可以從計(jì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范(JJG)得到佐證。JJG檢驗(yàn)的儀器，很多是在用儀器，它明確規(guī)定被檢儀器的指標(biāo)可以比新出廠的儀器指標(biāo)低，甚至有些指標(biāo)因?yàn)檫_(dá)不到要求而免檢。但我們的制造企業(yè)，在儀器出廠前，必須檢測(cè)系統(tǒng)的指標(biāo)，只有系統(tǒng)指標(biāo)達(dá)到設(shè)計(jì)要求時(shí)，才算合格，才能出廠。至于用戶(hù)換新檢測(cè)器、換新泵、同樣都是允許的。
 

2、使用者應(yīng)該對(duì)色譜柱及柱外的有關(guān)問(wèn)題引起高度重視

　　1)色譜峰拖尾：與柱、流動(dòng)相的流速、試樣等有關(guān)，發(fā)現(xiàn)拖尾一定要從這些方面查找原因;

　　2)如何延長(zhǎng)色譜柱壽命：保養(yǎng)很重要，長(zhǎng)期不用時(shí)用甲醇浸泡著，嚴(yán)格控制洗柱時(shí)間或洗柱溶劑體積，一般經(jīng)常使用的柱，下班時(shí)應(yīng)該用甲醇(或水：甲醇為20：80)洗 45分鐘或20倍床體積;

　　3)必須注意對(duì)“柱外效應(yīng)”的控制。所謂“柱外效應(yīng)”,就是指HPLC系統(tǒng)中，除柱系統(tǒng)外，管路、連接件、進(jìn)樣器和流動(dòng)池的死體積等引起的色譜峰增寬效應(yīng)。

　　4) 進(jìn)樣：自動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，應(yīng)該經(jīng)常檢測(cè)自動(dòng)進(jìn)樣器，對(duì)儀器進(jìn)樣器要求穩(wěn)定可靠;手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，應(yīng)該特別注意取樣時(shí)的細(xì)節(jié)，進(jìn)樣時(shí)的手感(輕、重、緩、急)等。

3、HPLC的使用者應(yīng)該特別注重對(duì)色譜柱質(zhì)量的判斷

　　1)色譜柱的柱效：塔板數(shù)高者好，特別要注意影響柱效的因素，塔板數(shù)降到一定程度該柱就報(bào)廢了。

　　2)重復(fù)性：一根柱子反復(fù)使用時(shí)， haoRSD能夠保持小于0.1%。

　　3)耐用性(壽命)：因?yàn)橹Ш苋菀捉档停孕枰匾晫?duì)柱的保護(hù)。

　　4)色譜柱使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、阻塞、降低塔板數(shù)。一般應(yīng)該用20倍床體積沖洗，隔幾天再用的HPLC， hao用20%甲醇：80%水沖洗30分鐘左右后，再用純甲醇沖洗20分鐘 后保存。

4、HPLC的使用者應(yīng)該特別重視流動(dòng)相問(wèn)題

　　1)PH值特別重要：一般C18柱PH小于3時(shí)，容易損壞色譜柱，但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。

　　2) 注意選擇試劑的截止波長(zhǎng)：如乙腈截止波長(zhǎng)215nm、丙酮截止波長(zhǎng)330nm、正丁烷210nm等等(具體情況請(qǐng)讀者參閱本文的參考文獻(xiàn))。

　　3)流速：流速要適當(dāng)，否則影響峰形、浪費(fèi)溶劑，一般常規(guī)分析工作大多選擇1ml/min。

5、使用者應(yīng)該注重溶劑前處理

　　 hao使用HPLC級(jí)的優(yōu)質(zhì)溶劑，使用前必須過(guò)濾和脫氣。注意以下幾點(diǎn)：

　　1)過(guò)濾目的：

　　溶劑進(jìn)泵前和樣品注射前應(yīng)該過(guò)濾除去溶劑中的微小顆粒、微生物，保證泵和色譜柱不會(huì)堵塞或損壞，保證分析數(shù)據(jù)可靠。

　　2)對(duì)過(guò)濾器的要求和 jia孔徑選擇方法：

　　對(duì)過(guò)濾器總的要求：速度快、溶出度小、死體積小、精 que的孔徑、體積適當(dāng)、化學(xué)兼容性好等。

　　 jia孔徑選擇方法：如果色譜柱填料直徑小于3µm或除菌過(guò)濾，一般選擇0.2µm孔徑;如果色譜柱填料直徑大于5µm，則選0.45µm;如果是預(yù)過(guò)濾或過(guò)濾難過(guò)濾的樣品，一般選1µm孔徑。特別是對(duì)使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液，更要注意選擇合適的過(guò)濾器!否則，不可能得到可靠的分析測(cè)試數(shù)據(jù)!

　　3)脫氣：

　　主要目的是：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡。液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。流動(dòng)相的氣泡進(jìn)入液相泵會(huì)引起壓力的上下波動(dòng)，危害很大，必須除之，可以打開(kāi)排空閥，大流速?zèng)_洗。

6、使用者應(yīng)該注重緩沖液?jiǎn)栴}

　　1) 緩沖液使用前必須過(guò)濾。

　　2) 溶劑、樣品易受到細(xì)菌和霉菌的影響，要注意清潔。

　　3)一般不能直接用有機(jī)溶劑做清洗沖洗。

　　4)梯度洗脫時(shí)，選低吸收值的緩沖液 ：

　　例如：梯度洗脫時(shí)，緩沖液與有機(jī)相應(yīng)預(yù)混，以防止析鹽。在保證峰不拖尾的情況下，盡可能選用低濃度的緩沖鹽，防止析鹽; 緩沖鹽濃度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流動(dòng)相中有機(jī)相含量高的話，流動(dòng)相中的鹽類(lèi)緩沖液濃度就不能過(guò)高，鹽的濃度起碼要保證在流動(dòng)相條件下不會(huì)析出。離子對(duì)緩沖液濃度要高一點(diǎn)，一般50～100mM。

7、研發(fā)者、使用者還特別需要重視12個(gè)常見(jiàn)的技術(shù)問(wèn)題。

　　這12個(gè)問(wèn)題是作者的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，是用好HPLC的科技工作者必須重視的問(wèn)題。(請(qǐng)讀者參考《李昌厚，高效液相色譜儀器及其應(yīng)用，北京：科學(xué)出版社，2014》一書(shū))。

8、使用者必須重視進(jìn)樣器的清洗問(wèn)題

　　進(jìn)樣器或進(jìn)樣針請(qǐng)注意三點(diǎn)：

　　A、對(duì)進(jìn)樣器要求：自動(dòng)進(jìn)樣和取樣速度快、有些儀器進(jìn)樣時(shí)間僅17秒。

　　B、進(jìn)樣室要求可控:一般用帕爾帖冷卻，溫控范圍4℃～100℃。

　　C、特別要應(yīng)注意進(jìn)樣殘留量的清洗(主要是清洗針)。
 

9、使用者應(yīng)該重視HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍(Linear Dynanic Range-LDR)及其測(cè)試方法

　　1)線性動(dòng)態(tài)范圍的定義
       上科技工作者對(duì)HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍的定義是：大線性區(qū)(保證1%相對(duì)誤差的線性區(qū)域)的吸光度值A(chǔ)_max，除以小線性區(qū)(保證1%相對(duì)誤差的線性區(qū)域)的吸光度值A(chǔ)min。即LDR=A_max/A_min;或大線性區(qū)的濃度C_max除以小線性區(qū)的濃度C_min，即LDR=C_max/C_min。

　　2)HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍的重要性(對(duì)分析測(cè)試誤差的影響)

　　定量分析檢測(cè)時(shí)，如果HPLC使用在非線性動(dòng)態(tài)區(qū)，肯定會(huì)因非線性而產(chǎn)生誤差。為了保證分析測(cè)試結(jié)果的可靠性，我們應(yīng)使用在HPLC的線性動(dòng)態(tài)區(qū)。因此，線性動(dòng)態(tài)范圍是一切HPLC使用者必須高度重視的技術(shù)指標(biāo)。

　　一般來(lái)說(shuō)，使用者拿到一臺(tái)HPLC儀器后，總是希望對(duì)很稀的樣品分析時(shí)，其分析測(cè)試的結(jié)果在所要求的誤差范圍內(nèi)。對(duì)很濃的樣品分析時(shí)，其分析測(cè)試的結(jié)果也在所要求的誤差范圍內(nèi)。這就只有HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍很寬的時(shí)候才能做到。有人認(rèn)為，樣品太稀時(shí)，濃縮一下就好了，樣品太濃時(shí)，稀釋一下就是了。這是不了解分析工作或未親自作過(guò)分析工作的人說(shuō)的話。因?yàn)?，濃縮一下或稀釋一下談何容易?首先是增加工作量，稀釋或濃縮工作很麻煩;第二，稀釋或濃縮會(huì)帶來(lái)誤差。所以我們總是希望HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍大(寬)且好。

　　HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍，一般取決于儀器檢測(cè)器的噪聲和雜散光。國(guó)內(nèi)外很多HPLC的生產(chǎn)廠商不給出HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍。作者認(rèn)為不給線性動(dòng)態(tài)范圍是不對(duì)的，因?yàn)椴唤o線性動(dòng)態(tài)范圍，就意味著不知道這臺(tái)HPLC分析的樣品濃度的上限和下限。綜上所述，HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍非常重要，它將限制儀器的使用范圍(即限制儀器的適用性)。很遺憾的是許多科技工作者目前還未對(duì)線性動(dòng)態(tài)范圍引起重視。

　　3)線性動(dòng)態(tài)范圍測(cè)試方法

　　HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)試方法有多種。我國(guó)的計(jì)量檢定規(guī)程JJG705-2002規(guī)定：波長(zhǎng)254nm時(shí)，采用“丙酮/2%異丙醇水溶液(丙酮含量為0.1%、0.2%、....1.0%)沖洗檢測(cè)池，并記下各溶液對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定記錄儀讀數(shù);由C_H/C_L算出檢測(cè)器的線性范圍(C_H濃度上限、C_L濃度下限)。”作者認(rèn)為這種方法很不妥。因?yàn)闈舛鹊南孪奘怯?jì)算出來(lái)的，不是真正測(cè)試出來(lái)的下限。采用的計(jì)算公式為：C_L=2NCV/H×20(公式本身有錯(cuò)誤);并且算出的下限值達(dá)到千萬(wàn)分之三點(diǎn)一(即：0.000031%)。這樣的數(shù)據(jù)有什么意義?作者認(rèn)為這種測(cè)試線性范圍的測(cè)試方法既不符合儀器學(xué)理論，又不與接軌，有關(guān)部門(mén)應(yīng)該盡快更正。

　　目前，上對(duì)線性動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)試方法，一般是配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品(以數(shù)量級(jí)遞增)，直接在儀器上測(cè)試其吸光度。求出偏離比耳定律1%時(shí)的大吸光度A_max和小吸光度A_min。二者相除即是儀器的線性動(dòng)態(tài)范圍LDR(Linine Dinamic Rangi)。即LDR=A_max/A_min。其具體操作是：HPLC儀器設(shè)置縱坐標(biāo)為吸光度A，橫坐標(biāo)為濃度C;檢測(cè)器的光譜帶寬為2nm;波長(zhǎng)設(shè)置可以在紫外區(qū)(如要求很高時(shí)可設(shè)置在253.7nm)，也可在可見(jiàn)區(qū)(如500nm);試樣可任選，濃度從小到大，依次對(duì)所配試樣進(jìn)行測(cè)試。作曲線，從曲線上找出偏離線性在1%以?xún)?nèi)的范圍。此范圍內(nèi)的A_max/A_min就是線性動(dòng)態(tài)范圍。

　　作者在研發(fā)HPLC的UV/FLD時(shí)，就是根據(jù)儀器學(xué)理論，從線性動(dòng)態(tài)范圍的物理概念出發(fā)，自己配置蒽不同濃度的溶液，以數(shù)量級(jí)遞增，測(cè)出能保證1%相對(duì)誤差的下限點(diǎn)和上限點(diǎn)，二者相除，得出其線性動(dòng)態(tài)范圍，效果非常好。