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無(wú)菌檢查法
附錄Ⅺ H 無(wú)菌檢查法
無(wú)菌檢查法系指檢查藥品、敷料、縫合線、無(wú)菌器具及適用于藥典要求無(wú)菌檢查的
其他品種是否無(wú)菌的一種方法。 
無(wú)菌檢查在潔凈度100級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防
止微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作臺(tái)面，必須進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。 
生物制品的無(wú)菌檢查，應(yīng)按《中國(guó)生物制品規(guī)程》中有關(guān)無(wú)菌檢查的規(guī)定辦理。 
培養(yǎng)基及其制備方法 
培養(yǎng)基應(yīng)適合需氣菌、厭氣菌或真菌的生長(zhǎng)，可按以下處方制備，亦可使用按該處
方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。以下培養(yǎng)基制備時(shí)，均以115℃滅菌30分鐘。
1.需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基(硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基) 
酪胨（胰酶水解） 15g 氯化鈉 2.5g 
葡萄糖 5g 新配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml 
L－胱氨酸 0.5g (或新配制的0.2％亞甲藍(lán)溶液0.5ml) 
硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.5～0.7g 
(或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml
酵母浸出粉 5g 
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，
煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.1±0.2，分裝，
滅菌。 
在供試品接種前, 培養(yǎng)基指示劑氧化層的顏色不得超過(guò)培養(yǎng)基深度約1/5，否則,須
經(jīng)水浴煮沸加熱, 只限加熱一次。 
2.真菌培養(yǎng)基 
胨 5g 　　　　　磷酸氫二鉀 1g 
酵母浸出粉 2g 硫酸鎂 0.5g 
葡萄糖 20g

水 1000ml 
除葡萄糖外，取上述成分加入水內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH值約為6.8，煮沸,加葡萄
糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。 
3.選擇性培養(yǎng)基 
(1) 對(duì)氨基苯甲酸培養(yǎng)基（用于磺胺類藥物的無(wú)菌檢查） 照上述需氣菌、厭氣菌
培養(yǎng)基及真菌培養(yǎng)基的處方及制法，各加對(duì)氨基苯甲酸0.125g，溶解后，搖勻,分裝,滅
菌。 
(2) 聚山梨酯80培養(yǎng)基（用于油劑藥品的無(wú)菌檢查） 照上述需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基
及真菌培養(yǎng)基的處方及制法，各加10ml聚山梨酯80，搖勻，分裝，滅菌。 
4.營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 
胨 10g 肉浸液 1000ml 
氯化鈉 5g 
取胨和氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH
值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。 
5.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 
照上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入15～20g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2
±0.2，分裝，滅菌。 
6.0.5％葡萄糖肉湯培養(yǎng)基 
胨 10g 葡萄糖 5g 
氯化鈉 5g 肉浸液 1000ml 
取胨和氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加葡萄糖溶解
后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。 
　　7.真菌瓊脂培養(yǎng)基 
照真菌培養(yǎng)基的處方及制法，加入15～20g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2,分
裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。 
上述培養(yǎng)基分別按15ml與40ml或需要量分裝于試管功其他容器中，裝量約為試管或
容器高度的2/5，按規(guī)定的溫度和時(shí)間滅菌。細(xì)菌培養(yǎng)基經(jīng)30～35℃培養(yǎng)48小時(shí),真菌培
養(yǎng)基經(jīng)20～25℃培養(yǎng)72小時(shí)后，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 【附注】 肉浸液制備法 取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細(xì)，絞碎后，每1000
g加水3000ml，充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時(shí)，煮沸1小時(shí)，濾過(guò)，壓干肉渣,補(bǔ)
足液量，分裝，滅菌，置冷暗處備用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代
替。 
培養(yǎng)基質(zhì)量應(yīng)通過(guò)靈敏度檢查。 
培養(yǎng)基靈敏度檢查法 
1.菌種 (1)藤黃微球菌(Micrococcus Luteus)[CMCC(B)28001] 
(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941] 
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]　　　　　　　　　　　　 
2.操作 (1)取藤黃微球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面和白色念珠菌的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新
鮮培養(yǎng)物,分別用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；將生孢梭菌不含瓊脂的需氣
菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，吸入無(wú)菌離心管，離心，棄去上清液,菌體用0.9％無(wú)菌
氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液。分別取上述菌懸液,用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至與細(xì)
菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管相同的濃度, 然后作10倍系列稀釋，制成1ml中含10～100個(gè)菌并計(jì)數(shù)?！　　　　　　　　　　　　?2)將藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物,白色念珠菌的真
菌培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液作10倍系列稀釋,制成1ml中含10～
100個(gè)菌并計(jì)數(shù)。
將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋菌液各1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣
菌、厭氣菌培養(yǎng)基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀釋菌液各1ml，分別接種至每管裝
量為12ml的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基3管,白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋菌液各1ml,接
種至每管裝量為9ml的真菌培養(yǎng)基3管,以未接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)5天
并逐日記錄結(jié)果。
3.結(jié)果判定 以每株菌接種后的培養(yǎng)基不得少于2管呈現(xiàn)生長(zhǎng)，即該培養(yǎng)基的靈敏
度檢查符合要求。
對(duì)照用菌液 
1.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌液 取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)
26003]的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi),在30～35℃培養(yǎng)
16～18小時(shí)后，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10～100個(gè)菌。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液 取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氣
菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1白金耳,接種至相同培養(yǎng)基內(nèi)，在30～35℃培養(yǎng)18～24小
時(shí)，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10～100個(gè)菌。
　　3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液 取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的真菌瓊
脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳,接種至真菌培養(yǎng)基內(nèi)，在20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)后，用
0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10～100個(gè)菌。
抑細(xì)菌和抑真菌試驗(yàn)
在用直接接種法無(wú)菌檢查前，可用如下方法測(cè)定供試品是否具有抑細(xì)菌和抑真菌作
用。用需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基4管及真菌培養(yǎng)基2管，分別接種金黃色葡萄球菌、生孢梭
菌、白色念珠菌均10～100個(gè)菌各兩管，其中1管加供試品規(guī)定量，所有培養(yǎng)基管置規(guī)定
的溫度，培養(yǎng)3～5天。如培養(yǎng)基各管24小時(shí)內(nèi)微生物生長(zhǎng)良好，則供試品無(wú)抑菌作用。
如加供試品的培養(yǎng)基管與未加供試品的培養(yǎng)基管對(duì)照比較，微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不
生長(zhǎng)，均判為供試品有抑菌作用。該供試品需用稀釋法（種入較大量培養(yǎng)基中）或中和
法、集菌儀薄膜過(guò)濾法處理，消除供試品的抑菌性后，方可接種至培養(yǎng)基。
檢查法
無(wú)菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過(guò)濾法全封閉集菌器。前者適用于非抗菌作用的供試品，后
者適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。
操作時(shí)，應(yīng)用適當(dāng)?shù)南疽簩?duì)供試品容器表面或外包裝浸沒(méi)或擦拭消毒后，以無(wú)菌
的方法取內(nèi)容物。
凡無(wú)菌檢查中，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對(duì)照。
1. 直接接種法 
(1) 供試品準(zhǔn)備 供試品如為注射液、供角膜穿通傷及手術(shù)用的滴眼劑或滅菌溶
液，按表1或表2規(guī)定量取供試品，混合。
供試品如為注射用無(wú)菌粉末或無(wú)菌凍干品或供直接分裝成注射用的無(wú)菌粉末原料，
按表1或表2規(guī)定量取供試品，加入無(wú)菌水或0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液,或該藥品項(xiàng)下規(guī)定的
溶劑用量制成一定濃度的供試品溶液。 
供試品如為外科敷料，取供試品4個(gè)包裝,以無(wú)菌操作拆開(kāi)包裝，于不同部位分別剪
取約100mg或1cm×3cm的供試品11份；腸線、縫合線取小包裝5個(gè)，拆開(kāi)包裝，共取11
股，接種于足以浸沒(méi)供試品的適量培養(yǎng)基中。 
供試品如為滅菌醫(yī)用器具，依樣品大小、形狀的不同，取供試品11個(gè)，接種于足以
浸沒(méi)供試品的適量培養(yǎng)基中?；蛴?.9％無(wú)菌氯化鈉溶液各40ml，分別沖洗內(nèi)壁（輸血、
輸液袋）收集各沖洗液，混合，按薄膜過(guò)濾法檢查。
供試品如為青霉素類藥品，按表1或表3規(guī)定量取供試品，分別加入足夠使青霉素滅
活的無(wú)菌青霉素酶溶液適量，搖勻，混合。亦可按上海秉越集菌儀薄膜過(guò)濾法檢查。
供試品如為放射性藥品，取供試品1瓶（支），接種于裝量為7.5ml的培養(yǎng)基中。每
管接種量為0.2ml。
2.操作 取上述備妥的供試品,以無(wú)菌操作將該供試品分別接種于需氣菌、厭氣菌
培養(yǎng)基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌對(duì)照用菌液1ml，作陽(yáng)性對(duì)照,另接種于真菌培
養(yǎng)基5管。輕輕搖動(dòng),使供試品與培養(yǎng)基混合。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管置30～35℃、真
菌培養(yǎng)基管置20～25℃培養(yǎng)7日。在培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。陽(yáng)性對(duì)照
管在24小時(shí)內(nèi)應(yīng)有菌生長(zhǎng)，如在加入供試品后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)7天后,不能從外
觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上
繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)2日，真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無(wú)菌生長(zhǎng)，或用
接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。 2. 薄膜過(guò)濾法 
如供試品有抗菌作用，按表1或表3規(guī)定量取供試品，按該藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法處理
后, 加入0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑至少100ml中, 混合后，通過(guò)裝有孔徑
不大于0.45μm的薄膜過(guò)濾器，然后用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶液沖洗濾膜
至陽(yáng)性對(duì)照菌正常生長(zhǎng)。將需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基用陽(yáng)性對(duì)照管用培養(yǎng)基
分別加至薄膜過(guò)濾器內(nèi)（全封閉式過(guò)濾器），或取出濾膜分成3等份,分別加入上述二種培
養(yǎng)基中，按規(guī)定溫度和時(shí)間培養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)根據(jù)供試品特性加入相應(yīng)對(duì)照菌液1ml(
抗細(xì)菌藥物，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌藥物，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真
菌藥物，以白色念珠菌為對(duì)照菌)。陽(yáng)性對(duì)照管細(xì)菌應(yīng)在培養(yǎng)24～48小時(shí)，真菌應(yīng)在培養(yǎng)
24～72小時(shí)有菌生長(zhǎng)。
結(jié)果判斷 
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管顯渾濁并確有細(xì)菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照管呈陰性時(shí)，可根據(jù)觀察所得的結(jié)
果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管均為澄清或雖顯渾濁但經(jīng)證明并非有菌生長(zhǎng),
均應(yīng)判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管中任何1管顯渾濁并確證為有
菌生長(zhǎng)，應(yīng)重新取2倍量供試品，分別依法復(fù)試，除陽(yáng)性對(duì)照管外，其他各管均不得有
菌生長(zhǎng)，否則應(yīng)判為供試品不合格。