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微生物純培養(yǎng)與生長量測定
一、微生物純培養(yǎng)技術(shù)
微生物在自然界中不僅分布廣，而且種類多，并多是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物類群分離開來，以得到只含一種微生物的純培養(yǎng)。微生物學(xué)中將在實驗室條件下由一個細胞或一種細胞群繁殖得到的后代稱為微生物的純培養(yǎng)。
純培養(yǎng)技術(shù)包括兩個基本步驟：① 從自然環(huán)境中分離培養(yǎng)對象。② 在以培養(yǎng)對象為生物種類的隔離環(huán)境中培養(yǎng)、增殖，獲得這一生物種類的細胞群體。針對不同微生物的特點，有許多分離方法。應(yīng)用廣的是平板法分離純培養(yǎng)。
（一）、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)
單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞生長群體，稱為菌落（colony）。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板（culture plate）的簡稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的常用手段。
1. 稀釋倒平板法（pour plate method）
先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)?！?br />2. 涂布平板法（spread plate method）
由于將含菌材料先加到還較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落（圖2-4）。
3. 平板劃線法（streak plate method）
用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。
4. 稀釋搖管法（dilution shake culture method）
用固體培養(yǎng)基分離嚴格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。
（二）、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)
對于大多數(shù)細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數(shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。
通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。
（三）、單細胞（孢子）分離
稀釋法有一個重要缺點，它只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。
對于較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進行。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液體來進行純培養(yǎng)物的分離。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。
（四）、選擇培養(yǎng)分離
沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。在一種培養(yǎng)基上接種多種微生物，只有能生長的才生長，其它被抑制。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設(shè)計一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過選擇培養(yǎng)進行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離，是十分重要的，特別對于從自然界中分離、尋找有用的微生物。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數(shù)場合下微生物群落是由多種微生物組成的，因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數(shù)量在10８時，必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數(shù)量僅為10２-３，顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶?shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養(yǎng)分離。
1. 利用選擇平板進行直接分離
主要根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長時若產(chǎn)生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。通過菌株培養(yǎng)時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解圈對產(chǎn)酶菌株進行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產(chǎn)蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開?？蓪⑽⑸锶郝潼c種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進行，得到純培養(yǎng)物。
2. 富集培養(yǎng)
主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個方面進行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等等許多方面。如采用富集方法從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸的微生物的實驗過程。首先配制以對羥基苯甲酸為碳源的液體培養(yǎng)基并分裝于燒瓶中，滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間，原來透明的培養(yǎng)液會變得渾濁，說明已有大量微生物生長。取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)，該過程經(jīng)數(shù)次重復(fù)后能利用對羥基苯甲酸的微生物的比例在培養(yǎng)物中將大大提高，將培養(yǎng)液涂布于以對羥基苯甲酸為碳源的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對羥基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲酸的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中大部分在含有對羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長，而在沒有對羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為沒有生長，說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目標(biāo)微生物。通過富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到純培養(yǎng)物。
富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家強有力的技術(shù)手段之一。營養(yǎng)和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段，只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養(yǎng)法也可用來分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計的特定環(huán)境中能生長的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長。
（五）、二元培養(yǎng)物
分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難作到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物，含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內(nèi)寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達到的接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。
在自然環(huán)境中，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養(yǎng)法在實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。對這些生物，二者的關(guān)系可能并不是嚴格的。這些生物中有些能夠純培養(yǎng)，但是其營養(yǎng)要求往往復(fù)雜，制備純培養(yǎng)的培養(yǎng)基很困難、很費事。
二、微生物生長量的測定
微生物學(xué)研究中常常要進行微生物生長量的測定，有多種方法用于微生物生長量的測定，概括起來常用的有以下幾種：
（一）直接計數(shù)法 ( 又稱全數(shù)法 )
1 、計數(shù)器直接測數(shù)法
取定量稀釋的單細胞培養(yǎng)物懸液放置在血球計數(shù)板 ( 細胞個體形態(tài)較大的單細胞微生物，如酵母菌等 ) 或細菌計數(shù)板 ( 適用于細胞個體形態(tài)較小的細菌 ) 上，在顯微鏡下計數(shù)一定體積中的平均細胞數(shù)，換算出供測樣品的細胞數(shù)。
（ 1 ）血球計數(shù)板及細胞計數(shù)
血球計數(shù)板是一種在特定平面上劃有格子的特殊載片。在劃有格子的區(qū)域中，有分別用雙線和單線分隔而成的方格。其中有以雙線為界劃成的方格 25( 或 16) 格，這種以雙線為界的格子稱為中格，其內(nèi)有以單線為界的 16 （或 25 ）小格。因此，用于細胞計數(shù)的區(qū)域的總小格數(shù)為：25×16 = 400 。該 400 個小格排成一正方形的大方格，此大方格的每條邊的邊長為 1 mm ，故 400 個小格的總面積為 1mm２。
在進行細胞計數(shù)前，先取蓋玻片蓋于計數(shù)方格之上，蓋玻片的下平面與刻有方格的血球計數(shù)板平面之間留有0.1mm 高度的空隙。含有細胞的供測樣品液被加注在此空隙中。加注在 400 個小格（ 1mm２ ）之上與蓋玻片之間的空隙中的液體總體積應(yīng)為：1.0mm×1.0mm×0.1mm = 0 . 1mm３
一般表示樣品細胞濃度的單位為：億個 / mL 。因此，在計數(shù)后，獲得在 400 個小格中的細胞總數(shù)，再乘以 10 ４ ，以換算成每 mL 所含細胞數(shù)。其計算公式如下：
菌液的含菌數(shù) /mL = 每小格平均菌數(shù)× 400 × 10 000 ×稀釋倍數(shù)
在進行具體操作時，一般取五個中格進行計數(shù)，取格的方法一般有兩種：① 取計數(shù)板斜角線相連的 5 個中格；② 取計數(shù)板 4 個角上的 4 個中格和計數(shù)板正中央的 1 個中格。對橫跨位于方格邊線上的細胞，在計數(shù)時，只計一個方格 4 條邊中的 2 條邊線上的細胞，而另兩條邊線上的細胞則不計；取邊的原則是每個方格均取上邊線與右邊線或下邊線與左邊線。