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超濾離心管的使用方法和注意事項(xiàng)
超濾離心管的使用方法和注意事項(xiàng)
離心管就是一個簡單的可以承受高轉(zhuǎn)速壓力的管子，比如離一些樣品，分離出上清沉淀。 蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，目前常用的就是Millipore的。目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定?？芍貜?fù)使用，使用一次就扔掉太浪費(fèi)。
離心超濾管會有一個類似于內(nèi)管和外管的兩個部分，內(nèi)管中是帶有一定分子量的膜，當(dāng)高速離心時，分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了，分子量比它大的就截留在上面(即內(nèi)管中)，就是超濾的原理。超濾離心管的選擇主要看你要截留那部分物質(zhì)，就選擇比最小分子量小的，如果你要截留26KD的，你要的超濾管就要比26小。但兩者也要有一定的差距，比如，選擇20-25KD之間的就不合適，因?yàn)?6的也可能會出去(這是由制造工藝決定的)。所以選擇20KD以下的超濾管比較合適。
以下是給大家總結(jié)的超濾離心管的使用方法和注意事項(xiàng)。
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選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，最常見的是10kD。到底選擇多大截留分子量比較合適呢?10kDa、 5kDa、還是30kDa?通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾 管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同，表格中有。
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新買來的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量*過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。
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平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機(jī)預(yù)冷至4度)。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同。具體可參閱附件里的說明書。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開離心機(jī)，否則離心機(jī)出問題時，無法第一時間處理，后果不可預(yù)測!膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直)。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
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當(dāng)濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止。
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前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾)，再 濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
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取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭(200ul)取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中，沒過 超濾膜，防止膜失水變干。
以下是處理超濾管，重復(fù)利用超濾管的步驟。
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倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起，然后倒掉，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將 管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內(nèi)壁再用 MilliQ水洗干凈。
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取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項(xiàng)，每根管用三四年不會壞。
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