菌種的管理與操作技術(shù)

菌（毒）種的管理與操作技術(shù)

中國藥品生物制品檢定所 王國治 中國疾病預(yù)防控制中心 王秋娣（感謝王老師的科學研究，致敬?。?/span>

摘要：菌（毒）種及樣品的運輸、保管、在實驗中的應(yīng)用與操作，是生物安全實驗室（微生物實驗室）安全管理的重要方面，為保證實驗室安全和實驗操作者免受其害，本文論述了菌（毒）種的管理和監(jiān)督系統(tǒng)文件制定、微生物操作技術(shù)規(guī)范、避免感染性物質(zhì)進入人體的的措施和對意外事故的處理方法。

關(guān)鍵詞：生物安全實驗室，菌（毒）種管理，微生物操作技術(shù)，事故處理

保證生物安全實驗室（微生物實驗室）安全，對菌（毒）種及樣品的運輸、保藏、使用等方面的管理是重要內(nèi)容之一。如何建立和執(zhí)行有效的管理與監(jiān)督制度、標準操作規(guī)程和實驗室操作技術(shù)規(guī)范是該類實驗室的重中之重。菌（毒）種的管理包括樣品的運輸、保藏、使用等方面的內(nèi)容，而對管理而言則是保證生物安全實驗室安全（包括微生物實驗室）的重要內(nèi)容之一。然而，菌（毒）種的管理應(yīng)建立規(guī)范和嚴格的管理制度以及對該制度的有效監(jiān)督，才能真正地防止在傳染病防治、科學研究以及生物制品生產(chǎn)過程中造成菌（毒）種的擴散或遺失，同時可避免發(fā)生實驗室感染或由其引起的相關(guān)傳染病的傳播事件；而規(guī)范的菌（毒）種的管理又可避免菌種在使用過程中發(fā)生不應(yīng)出現(xiàn)的差錯，同時保證菌毒種保藏的質(zhì)量以確保試驗結(jié)果的可靠性。

在日常的實際工作中可以發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)的實驗室將“傳代過程"與“數(shù)量"合并于研究記錄中的現(xiàn)象，或者是存在著記錄的不完整性，而記錄不正確的現(xiàn)象更是較為普遍。我們可以設(shè)想，如果在這一過程中缺少真正直接反應(yīng)實際工作狀況、獨立的傳代與銷毀記錄，將來則難以追蹤培養(yǎng)物的去向，這會不利于研究單位的安全自查和上級有關(guān)單位的核查，那么嚴格的督察也只能是形式上的監(jiān)督作用，而事實上卻無法真正確保生物安全實驗室的安全。因此，要求生物安全實驗室應(yīng)根據(jù)所從事的實際工作性質(zhì)來制定獨立的菌（毒）種保藏、開啟、傳代至銷毀的原始記錄，其中，記錄的內(nèi)容應(yīng)包括傳代菌（毒）種來源、傳代時間、傳代數(shù)量、傳代用途以及備注等；銷毀記錄應(yīng)包括銷毀方式、銷毀物品明細表（培養(yǎng)物、實驗用具等）、滅菌溫度與時間（開始時間，達到溫度時間，停止滅菌時間，取出時間）。當然，實驗記錄同時應(yīng)有實驗人與復(fù)核人并記錄在案。另則，實驗室負責人應(yīng)對記錄內(nèi)容負責，上級主管檢查人員以及國家督察人員應(yīng)將該項

目作為重點檢查的內(nèi)容之一，并對整個檢查過程進行認真而負責的督察，不應(yīng)疏忽任何的點滴，嚴格地按照規(guī)范的管理制度執(zhí)行，防止事故發(fā)生，為本單位和國家把好質(zhì)量關(guān)和安全關(guān)。

一、菌(毒）種管理與監(jiān)督系統(tǒng)的文件制定

為保證菌（毒）種管理體系能規(guī)范化制度化的正常運作，可以通過制定符合本單位實際情況的菌（毒）種管理及監(jiān)督標準操作規(guī)范（SOP）也是非常必要的，該（SOP）主要內(nèi)容包括：菌（毒）種管理與監(jiān)督標準操作細則，其內(nèi)容應(yīng)包括：菌（毒）種接收（分離）標準操作細則（SOP）；種子批制備與質(zhì)控標準操作細則（SOP）；菌（毒）種使用、保藏、分發(fā)標準操作細則（SOP）；菌（毒）種銷毀標準操作細則（SOP）；菌（毒）種事故應(yīng)急處理的標準操作細則（SOP）：菌（毒）種管理監(jiān)督的標準操作細則（SOP）。而對應(yīng)于各個細則可根據(jù)所研究的實際內(nèi)容或?qū)嶒炓?，制定更為詳細的每一種實驗的獨立操作細則，并為其設(shè)計相對應(yīng)的規(guī)范化表格化的原始記錄。以備日后各種驗證和檢查所需。

（一）菌（毒）種管理與監(jiān)督標準操作細則對于總則的內(nèi)容要包括菌（毒）種管理與監(jiān)督的制定SOP的指導思想、各種實驗內(nèi)容SOP的形成與批準程序、主要內(nèi)容提要以及全部SOP的目錄、實施與監(jiān)督。

1、菌（毒）種接收（分離）標準操作細則

菌（毒）種接收標準操作細則（SOP）要求內(nèi)容包括:

① 接收(外購、贈送)審批與接收程序;

② 菌（毒）種來源、背景資料、接收樣品檢驗的要求有原始記錄:

③ 菌（毒）種外購(接受贈送)申請表；

④ 菌種來源,背景資料登記記錄菌（毒）種入庫登記表；

⑤ 外來菌種傳代與檢驗記錄菌（毒）種分離標準操作細則（SOP）取樣程序;對菌種的來源,其背景資料的要求、樣品的分離操作(如分離過程比較復(fù)雜的可分別書寫各自獨立的SOP)

2、菌（毒）種種子批制備與質(zhì)控標準操作細則（SOP）。菌（毒）種種子批制備標準的操作細則（SOP）的內(nèi)容應(yīng)包括：

① 原代主代及工作種子批制備過程的各種工藝要求細則;

② 批準種子批發(fā)行使用程序,各過程還應(yīng)制定相對應(yīng)的實驗原始記錄。 需要注意的是：菌（毒）種種子批質(zhì)控標準操作細則（SOP）應(yīng)根據(jù)各菌（毒）

種的不同特性,制定相關(guān)的形態(tài)學、血清學、生化特性、免疫原性、純菌或外源因子檢查、核酸序列分析等檢定方法與結(jié)果判定。這要求在各個過程中都應(yīng)制定相對應(yīng)的實驗原始記錄并保存在檔。針對各項檢定項目應(yīng)制定相對應(yīng)實驗原始記錄，并有檢定結(jié)果的匯總表，種子批申請放行使用申請表與審批表等。

3、菌（毒）種使用、分發(fā)與保藏標準操作細則（SOP）。菌（毒）種使用、分發(fā)程序、菌（毒）種保藏方法的建立及驗證，菌（毒種的備份制度、菌（毒）種定期穩(wěn)定性檢查制度。

①菌（毒）種出、入庫登記表

②菌（毒）種使用申請表

③菌（毒）種保藏方法驗證記錄

④菌（毒）種定期穩(wěn)定性檢查記錄

4、菌（毒）種滅活與銷毀標準操作細則（SOP）。該標準操作細則應(yīng)由菌（毒）種銷毀申報審批程序、銷毀菌（毒）種復(fù)核程序、銷毀菌（毒）種滅活驗證方案等組成。還應(yīng)具備表格等的配套記錄。①菌（毒）種銷毀申報表

②菌（毒）種滅活與銷毀記錄

③銷毀菌（毒）種滅活驗證試驗記錄

5、菌（毒）種事故應(yīng)急處理標準操作細則（SOP）。各相關(guān)使用單位應(yīng)建立發(fā)生菌（毒）種丟失、破損或?qū)嶒炇野l(fā)事故的應(yīng)急處理辦法等標準操作細則。①菌（毒）種備份制度②事故申報表及相關(guān)處理記錄等報告6、菌（毒）種管理監(jiān)督標準操作細則（SOP）。應(yīng)要求各單位的生物安全部門必須重視菌（毒）種的管理監(jiān)督事項，定期了解本單位的菌（毒）種保管、檢定及使用情況的相關(guān)規(guī)定，并進行人員抽查考核制度，有效預(yù)防事故的發(fā)生。需建立以下記錄與表格等文件化的監(jiān)督標準。①制定現(xiàn)場抽查記錄（表）

②制定人員考核記錄（表）

③樣品來源,背景資料登記記錄

④菌(毒)種分離記錄

⑤外來菌種傳代與檢驗記錄

⑥菌（毒）種入庫或處理登記表

二、生物安全實驗室微生物操作技術(shù)規(guī)范

在實驗室內(nèi)標本的操作:包括其采集、內(nèi)部運輸、接收和打開標本的方法正確與否，都會增加或造成相關(guān)人員發(fā)生實驗室感染的危險性。因此，在進行感染性標本的操作時應(yīng)注意以下問題：

（一）樣品容器 樣品容器的材料可以是玻璃的，但建議最好使用塑料制品為宜。樣品容器本身要求堅固，并正確地用蓋子或塞子蓋好后應(yīng)檢查是否無泄漏。在容器外部不能有殘留物。容器上應(yīng)當正確地粘貼標簽以便于識別。樣品的要求或說明書不能卷在容器外面，而是要分開放置，最好能放置在防水的袋子里。樣品在設(shè)施內(nèi)的傳遞為了避免意外泄漏或溢出，應(yīng)當使用盒子等二級容器，并將其固定在架子上使裝有樣品的容器保持直立狀態(tài)。二級容器可以是金屬或塑料制品，但應(yīng)該可以耐高壓滅菌或耐受化學消毒劑的要求。密封口最好有一個墊圈并要求定期地清除污染。

（二）樣品接收 需要接收大量樣品的實驗室應(yīng)當具備專門的房間或空間。實驗室事故、傷害以及與工作有關(guān)的實驗室感染主要是由于人為失誤、不良實驗技術(shù)以及儀器使用不當而造成的，當實驗室樣品的收集以及內(nèi)部傳遞和接收不當時，都能夠帶來相關(guān)人員感染的危險。應(yīng)建立完善的管理制度與操作細則，避免或盡量減少這類問題或事故的發(fā)生。

（三）包裝開啟

作為接收和打開樣品的工作人員應(yīng)當了解樣品對身體健康的潛在危害的知情權(quán)，要了解并接受過如何采用常規(guī)預(yù)防措施的培訓，特別是處理破碎或泄漏的容器時更應(yīng)如此。樣品的開啟要在生物安全柜內(nèi)進行，并準備好消毒劑。

（四）移液管和移液輔助器的使用

1、應(yīng)使用移液輔助器，嚴禁用口吸取

2、所有移液管應(yīng)帶有棉塞以減少移液器具的污染

3、不能向含有感染性物質(zhì)的溶液中吹氣

4、感染性物質(zhì)不能夠用移液管反復(fù)吹吸混合

5、不能將液體從移液管內(nèi)用力吹出

6、刻度對應(yīng)(Mark—to—mark)移液管不需要吹出最后一滴液體的比較安全，因此最好使用這種移液管，以避免發(fā)生不必要的事故。

7、污染的移液管應(yīng)該*浸泡在盛有適當消毒液的防碎容器中。使用后的移液管應(yīng)當在消毒劑中浸泡18或24小時后再進行處理。

8、盛放廢棄移液管的容器應(yīng)當放在生物安全柜內(nèi)，直至高壓滅菌后方能放置在外面。

9、固定有皮下注射針頭的注射器不能夠用于移液。應(yīng)當用鈍頭導管替代針頭使用?？梢杂霉ぞ叽蜷_瓶塞后再用移液管取樣，從而避免使用注射器和針頭。

10、為了避免感染性物質(zhì)從移液管中意外滴出而擴散，在工作臺面應(yīng)當放置一塊浸有消毒液的無紡布或吸有消毒液的紙，使用后將其高壓滅菌或按感染性廢物進行處理。

（五）避免感染性物質(zhì)擴散的措施：1、在實驗操作過程中為避免轉(zhuǎn)移物質(zhì)灑落，微生物接種環(huán)的直徑應(yīng)為2—3mm并*封閉，手柄的長度應(yīng)小于6cm以減小振動?；蛘卟捎靡淮涡詼缇藓灐?、使用封閉式微型電加熱器消毒接種環(huán)應(yīng)避免在本生燈的明火上加熱，否則容易引起感染性物質(zhì)的爆濺。最好使用不需要進行再消毒的一次性接種環(huán)。3、為了避免產(chǎn)生氣泡和氣溶膠的擴散，不要在玻片上進行觸酶試驗，而應(yīng)當采用試管、毛細管或蓋玻片法。4、準備高壓滅菌和或處理的廢棄樣品和培養(yǎng)物應(yīng)當放置在防漏的容器內(nèi)，如實驗室廢物袋。

5、在每一階段的實驗工作結(jié)束后，必須采用適當?shù)南緞┣宄ぷ鲄^(qū)域的污染。

（六）生物安全柜的使用

當出現(xiàn)溢出、破損或不良操作時，安全柜就將不再具備能保護操作者的功能應(yīng)參考國家標準和相關(guān)文獻，正確掌握生物安全柜的使用方法和了解其局限性。并應(yīng)當建有書面的操作步驟、安全操作手冊等，在使用中應(yīng)注意以下事項：1、生物安全柜必須運行正常時才能使用。2、生物安全柜在使用中不能打開玻璃觀察擋板。3、安全柜內(nèi)應(yīng)僅放置本次實驗所需的器材或樣品，否則將阻礙后部的氣流循環(huán)。樣品在放人安全柜內(nèi)的工作區(qū)前需要清除表面污染。4、安全柜內(nèi)不能使用酒精燈，否則因燃燒而產(chǎn)生的熱量會干擾柜內(nèi)氣流并有可能將過濾器燒壞，致使過濾器損壞。允許使用微型電加熱器，但建議最好使用一次性無菌接種環(huán)。5、所有工作必須在工作臺面的中后部進行，并能夠通過觀察擋板觀看到。6、盡量減少操作者身后的人員流動，以免影響安全柜的氣流。7、操作者不應(yīng)反復(fù)移出和伸進手臂以免干擾氣流。8、實驗記錄、移液管以及其他物品不能夠阻礙前面的空氣格柵，因為這將干擾氣體流動，引起物品的潛在污染和操作者的暴露。9、

工作完成后以及每天下班前，應(yīng)使用適當?shù)南緞ι锇踩竦谋砻孢M行擦拭。10、工作開始前和結(jié)束后，安全柜的風機應(yīng)至少運行5分鐘。

三、避免感染性物質(zhì)注入人體

（一）針頭注射：1、通過認真練習和仔細操作，可以避免破碎玻璃器皿的意外刺傷。但建議在實驗室盡可能的用塑料制品代替玻璃制品。2、皮下注射針頭、玻璃吸管以及破碎的玻璃均可能將感染性物質(zhì)注入體內(nèi)。3、以下兩點可以減少針刺事故： (a)注射時特別小心；(b)減少使用注射器和針頭；（c）許多操作可用帶有鈍頭導管的注射器替代。也可用一些簡單的裝置來打開瓶塞，然后使用吸管取樣。4、不要重新給用過的針頭戴護套。一次性注射器用完后，不必將針頭從注射器上取下，應(yīng)丟棄在防穿透的帶蓋容器中。5、應(yīng)當用塑料吸管代替玻璃吸管。

（二）血清的分離：1、只有經(jīng)過嚴格培訓的人員才能進行這項工作。2、操作時應(yīng)戴手套以及眼睛和黏膜的保護裝置。3、規(guī)范的實驗操作技術(shù)可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產(chǎn)生。血液和血清應(yīng)當小心吸取，而不能傾倒。嚴禁用口吸液。4、移液管使用后應(yīng)*浸入次氯酸鹽或其他適當?shù)南疽褐?。移液管?yīng)在消毒液中浸泡至少18小時，然后再丟棄或滅菌清洗后重復(fù)使用。5、帶有血凝塊等的廢棄樣品管，在加蓋后應(yīng)當放在適當?shù)姆缆┤萜鲀?nèi)高壓滅菌和或焚燒。

6、為了清洗噴濺和溢出的血樣，應(yīng)當備有每天新鮮配制的次氯酸鹽溶液。

四、意外事故的處理

（一）菌（毒）外溢在臺面、地面和其他表面時的處理

1、戴手套，穿防護服，必要時需進行臉和眼睛防護。

2、用布或紙巾覆蓋并吸收溢出物。

3、向紙巾上傾倒適當?shù)南緞⒘⒓锤采w周圍區(qū)域。通常可以使用5%漂白劑溶液（次氯酸鈉溶液）；但在飛機上發(fā)生溢出時，則應(yīng)該使用季銨鹽類消毒劑，如苯扎溴銨等。

4、使用消毒劑時，從溢出區(qū)域的外圍開始，向中心進行處理。

5、作用適當時間后（例如30 分鐘），將所處理物質(zhì)清理掉。如果含有碎玻璃或其他銳器，則要使用簸箕或硬的厚紙板來收集處理過的物品，并將它們置于可防刺透的容器中以待處理。

6、對溢出區(qū)域再次清潔并消毒（如有必要，重復(fù)第2～5步）。

7、將污染材料置于防漏、防穿透的廢棄物處理容器中。

8、在成功消毒后，通知主管部門目前溢出區(qū)域的清除污染工作已經(jīng)完成。

（二）菌（毒）外溢在防護服上

此時應(yīng)立即進行局部消毒和更換。被污染的防護服要用消毒液浸泡后再進行高壓滅菌處理。

（三）菌（毒）外溢到皮膚粘膜

在實驗中發(fā)生菌（毒）外溢到皮膚粘膜的事故時，被視為有很大的危險存在，應(yīng)立即停止工作，能用消毒液的部位可進行消毒，然后用水沖洗15～20min ，，處理后方能安全撤離。并視情況隔離觀察，在此期間應(yīng)當根據(jù)條件進行適當?shù)念A(yù)防治療。

（四）皮膚刺傷

若發(fā)生皮膚被刺破時應(yīng)被視為有極大危險，應(yīng)立即停止工作，并對傷口進行擠血，用水沖洗消毒。并視情況隔離觀察，其間根據(jù)條件進行適當?shù)念A(yù)防治療。

（五）離心管發(fā)生破裂

1、非封閉離心桶的離心機內(nèi)盛有潛在感染性物質(zhì)的離心管發(fā)生破裂： ①如果機器正在運行時發(fā)生破裂或懷疑發(fā)生破裂，應(yīng)關(guān)閉機器電源，停止后密閉離心筒至少30min ，使氣溶膠沉積。

②如果機器停止后發(fā)現(xiàn)破裂，應(yīng)立即將蓋子蓋上，并密閉至少30min 。發(fā)生這兩種情況時都應(yīng)報告實驗室負責人。

③所有操作都應(yīng)加強個人呼吸保護并戴結(jié)實的手套（如厚橡膠手套），必要時可在外面戴適當?shù)囊淮涡允痔住?/span>

④當清理玻璃碎片時應(yīng)當使用鑷子，或用鑷子夾著的棉花來進行。所有破碎的離心管、玻璃碎片、離心桶、十字軸和轉(zhuǎn)子都應(yīng)放在無腐蝕性的、已知對相關(guān)微生物具有殺滅活性的消毒劑內(nèi)。未破損的帶蓋離心管應(yīng)放在另一個有消毒劑的容器中，然后回收。離心機內(nèi)腔應(yīng)用適當濃度的同種消毒劑反復(fù)擦拭，然后用水沖洗并干燥。清理時所使用的全部材料都應(yīng)按感染性廢棄物處理。

2、在可封閉的離心桶（安全杯）內(nèi)離心管發(fā)生破裂

所有密封離心桶都應(yīng)在生物安全柜內(nèi)裝卸。如果懷疑在安全杯內(nèi)發(fā)生破損，應(yīng)該松開安全杯蓋子并將離心桶高壓滅菌。還可以采用化學方法消毒安全杯。

參考文獻： Laboratory Biosafety Manual （WHO—第3版）

（感謝王老師的科學研究，致敬?。?/span>

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