原核蛋白表達(dá)常見問題

時間：2020/12/17閱讀：1634

蛋白不表達(dá)或表達(dá)量很低？

1、選擇正確的表達(dá)載體與表達(dá)菌株

• T7啟動子的載體(如pET系列載體)應(yīng)選用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動子的表達(dá)載體 (如Tac啟動子的pGEX、pMAL系列表達(dá)載體) 應(yīng)選用BL21表達(dá)菌株。

• 對細(xì)胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達(dá)低、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控誘導(dǎo)的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。

• 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。

2、嘗試不同的表達(dá)載體與菌株

不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一蛋白無法通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件得到明顯改善，可以更換其它菌株或表達(dá)載體。

3、表達(dá)條件的優(yōu)化

• 選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高表達(dá)量。

• 較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長的表達(dá)時間，一般可以加快表達(dá)的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達(dá)量。但可能會降低可溶蛋白的表達(dá)量，形成包涵體。

• 細(xì)胞的生長狀態(tài)對蛋白表達(dá)有很大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應(yīng)在菌株的對數(shù)生長期(OD600=0.5) 進(jìn)行誘導(dǎo)。

目的蛋白不可溶，形成包涵體？

首先確認(rèn)目的蛋白是否有表達(dá)。

• 裂解菌體并離心后，通過對全菌、上清、沉淀的檢測，確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)，是否形成了包涵體。

• 包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素有著密切關(guān)系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達(dá)載體與菌株，增強(qiáng)其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。

• 目前認(rèn)為包涵體的形成是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累速度過快，沒有正確折疊而聚集沉淀?？梢酝ㄟ^優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如降低誘導(dǎo)溫度、降低誘導(dǎo)物濃度、縮短表達(dá)時間、降低誘導(dǎo)時菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。

目的蛋白大小不正確？

• 蛋白的結(jié)構(gòu)對判斷分子量大小有一定影響。可以通過加熱變性蛋白，從而準(zhǔn)確判斷蛋白分子量大小。

• 確認(rèn)蛋白表達(dá)是否完整，蛋白是否提前終止表達(dá)。

• 若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段，破壞次級結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確判斷分子量大小。

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