前面寫了原代細(xì)胞的取代、分離，今天講述一下原代細(xì)胞的培養(yǎng)：

第三節(jié) 原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持   
一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持   
(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)   
1、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))   
凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來源的細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應(yīng)在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細(xì)胞不是用于長期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測(cè)定病毒之用，其細(xì)胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價(jià)提高和測(cè)定結(jié)果（如空斑）更加明顯、準(zhǔn)確，待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)的pH若有明顯變化，應(yīng)將原代細(xì)胞換液，即倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基，以便除去衰老、死亡的細(xì)胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細(xì)胞能獲得充足的營養(yǎng)。   
若用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時(shí)，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞開始貼壁生長，為了利于該貼壁細(xì)胞充分貼壁和生長，此時(shí)換液應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細(xì)胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次換液后，貼壁肌樣細(xì)胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)換液可將原懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶，然后分別補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對(duì)半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng)，原瓶的貼壁細(xì)胞逐漸長成單層，而新瓶中又會(huì)出現(xiàn)二次貼壁細(xì)胞，經(jīng)幾次換液也會(huì)逐漸長成單層，在此類細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（濃度要在20%以上），以利細(xì)胞貼壁生長。   
2、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)   
凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞。若作用于試驗(yàn)的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞濃度可在5～8×109/L范圍內(nèi)，然后進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行長期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長，待細(xì)胞開始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明細(xì)胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細(xì)胞不丟失），待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時(shí)，此時(shí)可考慮傳代。但千萬不能急于傳代，一定要待細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行，以防傳代失敗。  

(二)原代細(xì)胞的維持   
1、貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的換液）   
貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細(xì)胞生長，此時(shí)細(xì)胞還未長成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量全部培養(yǎng)基。若希望細(xì)胞能在較長時(shí)間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時(shí)要換成含2%小牛血清的維持液。   
2、懸浮細(xì)胞   
凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細(xì)胞不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細(xì)胞不適宜生長，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長期培養(yǎng)時(shí)，都需換液培養(yǎng)，待達(dá)到飽和密度時(shí)才能傳代。換液時(shí)，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。 
半量換液的方法如下：   
將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮全部培養(yǎng)基。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮全部培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   
二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的第一次傳代   
原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度，貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳至5～10代以內(nèi)的細(xì)胞通常稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞，傳至10~20代以上的細(xì)胞，通常確定為傳代細(xì)胞（或稱傳代細(xì)胞系）。然而，傳代細(xì)胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的第一次傳代。 
應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：   
(1)細(xì)胞生長密度不高時(shí)，或未能達(dá)到覆蓋整個(gè)瓶底時(shí)不能急于傳代。   
(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞多為混雜細(xì)胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存，采用胰蛋白酶消化時(shí)要掌握好消化時(shí)間，因成纖維細(xì)胞易于脫壁，上皮細(xì)胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間及時(shí)中止消化。在早先傳代時(shí)，其消化時(shí)間比一般已建系的細(xì)胞相對(duì)長一些。   
(3)吹打已消化的細(xì)胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。   
(4)第一次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以利于細(xì)胞的生存和繁殖。如果消化分離的細(xì)胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細(xì)胞損失。   
(5)第一次傳代培養(yǎng)時(shí)的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當(dāng)加大至15%～20%左右。   
三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)   
原代細(xì)胞經(jīng)傳代后所形成的傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。后兩種傳代方法比較簡單，唯有貼壁細(xì)胞的消化傳代法比較復(fù)雜一些。 
現(xiàn)將具體方法介紹如下：   
(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。   
(2)每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。   
(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到“薄膜"現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2～3分鐘，輕輕搖動(dòng)，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化。   
(4)加入全部培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。   
(5)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。   
四、傳代細(xì)胞的建系和維持   
細(xì)胞系的維持是培養(yǎng)工作的重要內(nèi)容，是通過換液傳代再換液、再傳代和細(xì)胞種子凍存來實(shí)現(xiàn)的，但對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系來說都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持須注意以下幾點(diǎn)：   
1.細(xì)胞檔案   
細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時(shí)間、擴(kuò)增時(shí)間(分裂指數(shù))，細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志(標(biāo)記染色體)等，這些記錄對(duì)于保證細(xì)胞的正常生長，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。   
2.換液傳代   
(1)細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時(shí)，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長特性的改變，給以后的實(shí)驗(yàn)帶來影響。   
(2)多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，對(duì)所用的試劑各系不能交叉，甚至每個(gè)細(xì)胞系均需單獨(dú)實(shí)驗(yàn)室，傳代時(shí)各系均分開單獨(dú)操作，每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時(shí)均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時(shí)間。若細(xì)胞生長較快，可減去換液程序，每次均可傳代。每個(gè)傳代細(xì)胞系，最好能分成2～3條線，分別傳代，同時(shí)也可在適溫或4℃短期存放一瓶，以防止污染丟失。細(xì)胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。   
3.細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理   
當(dāng)一個(gè)細(xì)胞系（或株）建立后，專家鑒定可有可無，按國際慣例，只要認(rèn)真研究，記錄完整，資料和結(jié)果確切，就可在有關(guān)雜志上或刊物上報(bào)道細(xì)胞的各次實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。   
下面為美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行（ATCC）入庫細(xì)胞的基本要求：   
（1）培養(yǎng)簡歷 組織來源日期、物種、組織來源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)，細(xì)胞已傳代數(shù)等。   
（2）凍存液 培養(yǎng)基和保護(hù)劑名稱。   
（3）細(xì)胞活力 凍融前后細(xì)胞接種存活率和生長特性(生長繁殖曲線，分裂指數(shù)等)。   
（4）培養(yǎng)液 培養(yǎng)基種類和名稱、血清來源及濃度。   
（5）細(xì)胞形態(tài) 類型，如上皮或成纖維細(xì)胞等。   
（6）核型 二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體有或無。   
（7）無污染情況 包括細(xì)胞、真菌、支原體、原蟲和病毒等。   
（8）物種檢測(cè) 檢測(cè)同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有無交叉污染。   
（9）免疫檢測(cè) 一兩種血清學(xué)檢測(cè)。   
（10）細(xì)胞建立者 建立者姓名、檢測(cè)者姓名。    
第四節(jié) 細(xì)胞的純化和克隆   
體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物體內(nèi)或胚胎組織，其體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，來源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，即有上皮樣細(xì)胞，又有纖維樣細(xì)胞，纖維樣細(xì)胞又包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等，混雜的細(xì)胞會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣才能對(duì)某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等變化進(jìn)行一系列研究，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步，甚至需要從混雜的細(xì)胞群中分離出單個(gè)細(xì)胞來進(jìn)行培養(yǎng)和開展實(shí)驗(yàn)研究。   
一、細(xì)胞的純化   
細(xì)胞的純化一般分為兩種，即自然純化和人工純化?？筛鶕?jù)不同細(xì)胞種類、來源、實(shí)驗(yàn)要求和目的選擇采用。   
(一)自然純化   
自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及目的來選擇細(xì)胞，此法花費(fèi)時(shí)間長，留下來的往往是成纖維細(xì)胞。僅有那些惡性變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過此方法而保留下來，不斷純化而建立細(xì)胞系。   
(二)人工純化   
人工純化，即利用人為手段造成某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。   

1、細(xì)胞因子依賴純化法   
人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長期存活和生長繁殖，如IL-2是T細(xì)胞生長所必需的細(xì)胞因子，BCGF是B細(xì)胞的生長因子，體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長繁殖，形成IL-2依賴的T細(xì)胞系，如CTLL-2細(xì)胞株，而其他細(xì)胞則自然被淘汰，采用此法還建立了IL-6依賴的細(xì)胞系，如B9、CTD7細(xì)胞株。   
2、酶消化法   
酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的，對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。   
（1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化   
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時(shí)間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。 
方法如下：   
①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加1mL（25mL培養(yǎng)瓶）來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面，然后倒掉。   
②蓋好瓶塞（或蓋），將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化。   
③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長的區(qū)域（可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào)）。吹打時(shí)不要用力，也不要吹打上皮細(xì)胞生長區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過幾次處理，就可將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_。   
（2）骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化   
在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上，種類混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開和純化的目的。 
其方法如下：   
①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí)，倒去舊液，加入無鈣、鎂PBS漂洗，并用力搖動(dòng)后倒掉，反復(fù)洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉，但仍留有不少粘附細(xì)胞。   
②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶1mL（25mL培養(yǎng)瓶），輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過細(xì)胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去。   
③蓋好瓶蓋，在普通顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁，而原先粘附的細(xì)胞已浮起，此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉，盡量除去粘附細(xì)胞。   
④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔幾日或下次傳代前，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附細(xì)胞去除，將兩者分開，達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的。   
3、機(jī)械刮除法   
原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上?？刹捎脵C(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域。

其方法如下：   

(1)將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行。   
(2)用硅橡皮刮子在不需要生長的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞。   
(3)推劃后用培養(yǎng)液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   
(4)數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長出，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過程中要嚴(yán)格無菌操作，防止污染。   
4、反復(fù)貼壁法   
成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快，大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)（大約10~30min）完成附著過程（但不一定全部伸展），而上皮細(xì)胞（大部分）在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。 
其方法如下：   
(1)將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)（最好培養(yǎng)液內(nèi)不含血清，此時(shí)上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置20分鐘。   
(2)在倒置顯微鏡下觀察，見部分細(xì)胞貼壁，稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí)，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min，然后再重復(fù)上述操作后，即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開，在第1瓶和第2瓶以成纖維細(xì)胞為主，往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主，下次傳代時(shí)再按上述方法處理，就可使兩者達(dá)到全部分開的目的。   
5、電烙篩選法   
在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長趨勢(shì)，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，此時(shí)即可用機(jī)械刮除法去除未轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。 
其方法如下：   
(1)倒去舊液，并用記號(hào)筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域。   
(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死，只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。在單細(xì)胞克隆篩選時(shí)，也可用此法將單個(gè)細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死，然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng)，即可達(dá)到純化的目的。   
二、細(xì)胞的克隆化   
        細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個(gè)克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。它們當(dāng)中每個(gè)細(xì)胞的遺傳特征和生物學(xué)特性極為相似和一致，有利于對(duì)不同群體細(xì)胞的形態(tài)和功能進(jìn)行比較和研究。若該細(xì)胞株只是一般傳代、無一系列實(shí)驗(yàn)鑒定指標(biāo)，則為一般細(xì)胞株。若有一系列實(shí)驗(yàn)指標(biāo)報(bào)道的，則稱為限定性細(xì)胞株，如由幼地鼠腎細(xì)胞系（BHK21）第13孔的單個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞株稱BHK-21C-13（代表克隆13），其形態(tài)規(guī)則，特性穩(wěn)定，便于研究。   

        單一細(xì)胞體外培養(yǎng)能否生長繁殖最后形成克隆，這與各細(xì)胞克隆形成率有關(guān)，如果細(xì)胞克隆形成率偏低（小于10%）應(yīng)采用一些措施，如改用胎牛血清，適應(yīng)性培養(yǎng)基添加刺激因子（如胰島素、地塞米松、細(xì)胞生長因子等），調(diào)節(jié)CO2濃度以控制pH。若貼壁效果差可選用適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性底物（如膠原層或血漿纖維蛋白層），以及制備底層的飼養(yǎng)細(xì)胞。用X線或60Co照射處理的細(xì)胞層，如雞胚細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞照光后只有代謝功能，無增殖和傳代能力，或選用短壽的細(xì)胞，常選用鼠腹水巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞，用于單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的克隆化。
具體克隆方法如下：   
1.毛細(xì)管法：   
將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個(gè)細(xì)胞/mL，取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中，在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個(gè)細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴(kuò)展，并形成單個(gè)克隆的細(xì)胞群體。   
2.有限稀釋法   
有限稀釋法采用梯變倍數(shù)稀釋的原則，將稀釋的細(xì)胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板中（也可在板上的96孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時(shí)間后，孔中可出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞克隆，本法不需特殊設(shè)備，操作簡單快速，適合大批量克隆化培養(yǎng)?，F(xiàn)已廣泛用于異質(zhì)性細(xì)胞系的克隆化培養(yǎng)、誘導(dǎo)和分離耐藥性或高轉(zhuǎn)移性、或突變細(xì)胞株以及單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的克隆篩選中。 
具體方法如下：  
（1）取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。   
（2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至50個(gè)細(xì)胞/mL、10個(gè)細(xì)胞/mL、5個(gè)細(xì)胞/mL，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于37℃ 5%CO2下培養(yǎng)。   
（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加0.1mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。   
（4）培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)，待長至孔底面的1/3～1/2時(shí)，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。  

3.平皿克隆分離法   
        在平皿內(nèi)將單個(gè)細(xì)胞形成克隆并進(jìn)行分離培養(yǎng)的方法如下：   
(1)將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制備單個(gè)細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。   
(2)將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1周或更長。若有明顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：   
①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況， 標(biāo)記單個(gè)克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有少量無菌硅脂的無菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量0.25%胰蛋白酶，待細(xì)胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉(zhuǎn)入小平皿或24孔板或6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。   
②玻片法：在接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在60mm平皿中放入無菌小玻片，加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個(gè)克隆的玻片，然后用無菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。   
4.軟瓊脂克隆分離法   
本法僅適用于懸浮培養(yǎng)的類淋巴細(xì)胞或惡性程度高的貼壁細(xì)胞，而正常貼壁細(xì)胞在軟瓊脂中不能形成克隆。   
（1）將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個(gè)細(xì)胞)作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106細(xì)胞/L，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個(gè)細(xì)胞/L為佳。   
（2）制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂全部溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷至50℃，迅速加入9份預(yù)溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。   
（3）制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。   
（4）于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長，若需培養(yǎng)更長時(shí)間可補(bǔ)加0.8mL/孔含瓊脂的培養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。   
（5）集落（克?。┯?jì)數(shù)：在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)直徑大于75μm或含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆。  

5．單細(xì)胞顯微操作法   
借助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個(gè)細(xì)胞逐個(gè)吸出，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。本法準(zhǔn)確性好，如無顯微操縱器可自制毛細(xì)吸管替代。

方法如下：   
（1）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 單個(gè)細(xì)胞在極低密度下生長非常緩慢，甚至難以分裂，為了促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長繁殖，常采用飼養(yǎng)層細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞種類和制備方法依實(shí)驗(yàn)要求而定，現(xiàn)以3T3小鼠纖維細(xì)胞為例：   
①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長的3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細(xì)胞懸液于37℃ 5% CO2中培養(yǎng)至單層。   
②將已形成單層的3T3細(xì)胞板，用60Co γ線以4000～6000拉得輻射或在培養(yǎng)液中加入mitomycin（終濃度為10-6mol/L）作用16h。其目的是使細(xì)胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH而且還可為克隆細(xì)胞提供必要的養(yǎng)分及刺激生長的因子。飼養(yǎng)細(xì)胞處理后需更換新鮮培養(yǎng)液。   
(2)制備單個(gè)細(xì)胞懸液 方法同上。   
(3)分離單個(gè)細(xì)胞 其方法多樣，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件決定：   
①毛細(xì)管吸入法 同上述毛細(xì)管法，在顯微鏡下將只有一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管取出。   
②微滴法 將經(jīng)稀釋至103個(gè)細(xì)胞/L的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細(xì)胞的液滴，再用毛細(xì)管取出單個(gè)細(xì)胞懸滴。   
③液體石蠟法 將經(jīng)稀釋至103個(gè)細(xì)胞/L的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加入充滿無菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細(xì)胞液滴，仔細(xì)用毛細(xì)吸管取出有一個(gè)細(xì)胞的液滴。   
④玻璃小球附著法 將稀釋至103個(gè)細(xì)胞/L的細(xì)胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細(xì)胞的玻珠，仔細(xì)用鑷子取出。   
(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細(xì)胞，放入預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長。   
(5)待細(xì)胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/3～1/2時(shí)，即可將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉(zhuǎn)種）。