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不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的原理及區(qū)別

時(shí)間：2023/11/10閱讀：704

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染）。前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白、β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小。大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因）、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

轉(zhuǎn)染方法

原理

王要應(yīng)用

特點(diǎn)

DEAE-葡萄糖法

帶正電的DEAE-葡萄糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)比磷酸鈣好，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一般只用于BSC-1、CV-1、COS細(xì)胞系

磷酸鈣法

磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，染瞬轉(zhuǎn)染

不適用于元代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高），操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染拷貝數(shù)較多

陽(yáng)離子脂質(zhì)體法

帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過細(xì)胞時(shí)內(nèi)吞左右而被進(jìn)入細(xì)胞。（若DNA濃度過高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力）

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞

使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用

陽(yáng)離子聚合物

帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞

除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑

病毒介導(dǎo)法

逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA）

通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞

可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大（<8kb），細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素

腺病毒（雙鏈DNA）

先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞

可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，需考慮安全因素

Biolistic顆粒傳遞法（基因槍粒子轟擊法）

將DNA用顯微鏡金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放、表達(dá)

瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

可用于：人的表皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞

顯微注射法

用顯微鏡操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成小孔導(dǎo)入

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞

適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組(>65kb)但細(xì)胞致死率高， DNA和細(xì)飽用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少

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