PriCells: 正常小鼠腹股溝脂肪墊獲取脂肪源干細(xì)胞                                                                       PDF下載

實(shí)驗(yàn)材料：
1. Hank’s緩沖鹽溶液（HBSS）；
2. ASC培養(yǎng)基：含10%胎牛血清的DMEM，添加1%的P/S；
3. 膠原酶溶液：100ml Hank’s緩沖鹽溶液中加入1g牛血清白蛋白和0.1gⅡ型膠原酶；
4. 聚乙烯吡咯酮碘溶液；
5. 陪替氏培養(yǎng)皿，9cm；離心管，50ml；組織培養(yǎng)瓶，25cm²；
6. 剪刀（2把），鑷子（2把）；
7. PBSA；
8. 小鼠，4—6只；
9. 麻醉劑：三溴乙醇；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 37℃水浴中預(yù)熱HBSS和脂肪源干細(xì)胞培養(yǎng)基；
2. 麻醉動(dòng)物后處死；
3. 轉(zhuǎn)移動(dòng)物至層流凈化罩中；
4. 70%酒精消毒腹部；
5. 采用低位橫向切口打開腹腔；
6. 用鑷子取出性腺/附睪和腹股溝處的脂肪墊；
7. 將脂肪組織置于培養(yǎng)皿中，加入HBSS；
8. 待所有動(dòng)物脂肪取出后，將脂肪轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中；
9. 加入含有5%聚乙烯吡咯烷碘酮的HBSS 2—3min；
10. 漂洗組織并用HBSS洗滌脂肪；
11. 用無菌鑷子將脂肪轉(zhuǎn)移至50ml離心管中；
12. 用無菌剪刀將脂肪切碎；
13. 加入與組織體積相同的膠原酶溶液并混勻；
14. 將離心管置于37℃水浴中60min，其間不時(shí)混勻一下；
15. 離心，50—100g，5min；
16. 取出離心管，用力搖晃（將基質(zhì)細(xì)胞與原代脂肪細(xì)胞*分離），再次離心5min；
17. 小心吸去上層油脂，油脂層中含有原代脂肪細(xì)胞，注意不要破壞位于下方的基質(zhì)—血管細(xì)胞層；
18. 加入5—10ml PBSA，重懸沉淀，再次離心5min；
19. 洗滌三次，注意不要吸走基質(zhì)—血管細(xì)胞層；
20. 最后一次洗滌后，加入8ml ASC培養(yǎng)基重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO_²溫箱中；
21. 待細(xì)胞貼壁生長2—4天后換液；
22. 換液時(shí)通過棄去培養(yǎng)基，從而去除未貼壁的細(xì)胞；
23. 以后每周更換培養(yǎng)基2次；