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如何讓樣品保持在生理狀態(tài)
為什么持續(xù)控制氧氣特別重要?
氧氣是大多數(shù)生命形態(tài)存在的基本要素。對(duì)于生命科學(xué)研究人員而言，氧氣是一種電子受體，一種生命所必需的高活性分子，以及一種影響生物中每一個(gè)單一活動(dòng)和反應(yīng)的分子。一般情況下，大氣含氧量被認(rèn)為是21%。
然而，當(dāng)吸入空氣時(shí)，組織氧合下降到約5%。從肝至肺上皮中，氧氣水平約為14%，腸粘膜腔實(shí)際上是無(wú)氧的。在這些百分比中，不同的組織中有不同的氧氣水平，但最重要的是，沒(méi)有一個(gè)組織的細(xì)胞會(huì)暴露在21%的氧氣水平中。事實(shí)上，21%的氧氣會(huì)形成活性氧自由基(ROS)及其中間體，因此對(duì)細(xì)胞具有高毒性。當(dāng)產(chǎn)生的ROS超過(guò)細(xì)胞的抗氧化能力時(shí)，ROS就開(kāi)始破壞大分子，如蛋白質(zhì)、脂類和DNA。
缺氧是細(xì)胞和組織通過(guò)血流增加、血管舒張或上調(diào)氧應(yīng)答基因?qū)σ欢ǖ难鯕馑阶鞒鲰憫?yīng)，以期維持它們的氧氣水平。這些響應(yīng)會(huì)在氧氣水平低于某一特定點(diǎn)后發(fā)生，這個(gè)點(diǎn)在各組織和細(xì)胞間各不相同。正常組織在3%到10%的氧氣水平之間得以維持，低于該水平被視為低氧狀態(tài)（最恰當(dāng)?shù)拿枋鍪侨毖酰?/p>
由于是在非生理?xiàng)l件下進(jìn)行研究,因此,在很多，甚至可能是大部分的研究中都要隱藏生理表型。由此，了解各項(xiàng)研究中器官或組織的氧氣水平，以獲得可轉(zhuǎn)移的和生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是很重要的。每個(gè)組織和器官都有各自的氧合狀態(tài)，反映了各自的功能。當(dāng)氧氣含量過(guò)高或過(guò)低時(shí)，其影響涉及單基因表達(dá)到蛋白質(zhì)組水平。
Baker Ruskinn公司的OxyGenie
OxyGenie是一個(gè)小型便攜式孵育平臺(tái)，可將您的樣品保持在缺氧狀態(tài)或您想要的空氣中。OxyGenie可以由電源以及電池驅(qū)動(dòng)，不管是在實(shí)驗(yàn)室，還是外面 , 您都可以控制樣品狀態(tài)。它由1至6個(gè)獨(dú)立的1孔培養(yǎng)室組成，每個(gè)培養(yǎng)室有自己的進(jìn)氣口。OxyGenie配有兩個(gè)循環(huán)充氣瓶(Catalina Cylinders，美國(guó)加利福尼亞州)，可以充您想要的氣體成分比例。通過(guò)調(diào)整氣瓶的出口壓力來(lái)調(diào)節(jié)氣體流量。兩個(gè)裝滿的氣瓶可供6個(gè)樣品室使用16小時(shí)。溫度由ITO加熱器和控制器（Okolab s.r.l.，意大利）控制。每個(gè)樣品室下方都有一個(gè)6孔分流器，通過(guò)該分流器，細(xì)胞可以在不中斷生理參數(shù)的情況下，例如在光學(xué)顯微鏡成像時(shí)與基底分離。
圖1. A：Baker Ruskinn OxyGenie移動(dòng)式孵化器。B：組裝硅細(xì)胞培養(yǎng)孔
樣品室經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。樣品室的底座為高質(zhì)量的玻璃蓋。每個(gè)樣品都是一個(gè)迷你孵化器，配有不同的蓋子和鎖。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的樣品室可容納1mL的樣品培養(yǎng)基，并以光學(xué)透明玻璃蓋密封。蓋鎖是為了預(yù)防潛在的蒸發(fā)。外蓋鎖將蓋子牢固密封。最后一層外蓋與系統(tǒng)的氣體軟管連接。
為Coral Life改編
為了在整個(gè)活細(xì)胞CLEM工作流中維持合適的生理?xiàng)l件，我們利用了OxyGenie可以在冷凍固定之前確保細(xì)胞生理狀態(tài)的能力。然而，為了適應(yīng)工作流的需要，我們做了一些定制化的改變:
在EM ICE上進(jìn)行高壓凍結(jié)時(shí)，使用6 mm的藍(lán)寶石盤作為樣品培養(yǎng)皿。此外，為了實(shí)現(xiàn)最佳的實(shí)時(shí)成像，能否在藍(lán)寶石盤上實(shí)現(xiàn)水浸式成像至關(guān)重要。因此，我們將腔室底部的玻璃蓋換成一個(gè)在中心有6.5 mm孔的35 × 35 × 1 mm玻璃載玻片（稱為SampLink樣品杯)。該孔與EM ICE中間板對(duì)齊，直達(dá)藍(lán)寶石盤的中心。使用蠟封將中間板和藍(lán)寶石基底連接到SampLink基杯的底部。中間板與SampLink基杯的對(duì)齊和連接見(jiàn)Coral Life操作手冊(cè)的5.2節(jié)的描述。
成像后，EM ICE中間板必須快速脫離SampLink。因此，EM ICE加樣區(qū)配備了滑動(dòng)和分離機(jī)制，可將中間板從玻璃基底分離，并將其直接放置在正確的位置進(jìn)行冷凍。
圖2：為Coral Life準(zhǔn)備的EM ICE加載區(qū)。
SampLink室的細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性
為確保樣品在改良后的SampLink室中保持活性，需要開(kāi)展細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)使用哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞系L-929 (ATCC編號(hào)CCL-1，批號(hào)13)，由奧地利維也納的OFI技術(shù)與創(chuàng)新公司執(zhí)行。細(xì)胞(105細(xì)胞/ ml)接種在藍(lán)寶石盤上(50 μl)或整個(gè)樣品室底部(500 μl)。作為對(duì)照，將相同的稀釋細(xì)胞接種在96孔板(50 μl)或12孔板(500 μl)中。樣品和對(duì)照品在37°C和5%二氧化碳水平下孵育24小時(shí)。測(cè)試細(xì)胞毒性，以評(píng)估牙蠟對(duì)種子細(xì)胞質(zhì)量的影響(圖3)。根據(jù)ISO 10993--5:2009標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定細(xì)胞毒性。
圖3：可見(jiàn)與EM ICE中板接觸的、在藍(lán)寶石盤側(cè)的牙蠟(紅色圈)。
為進(jìn)行光學(xué)評(píng)估，用MTT對(duì)樣品進(jìn)行了染色
活細(xì)胞可將MTT轉(zhuǎn)化生成甲臜，顏色由黃色變?yōu)樽仙?藍(lán)色，可通過(guò)光度計(jì)的吸收測(cè)量來(lái)檢測(cè)。去除培養(yǎng)基，用50 μl或500 μl MTT溶液（DMEM中1 mg/ml）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在37℃，5%二氧化碳水平中孵育2小時(shí)。然后用50 μl或500 μl異丙醇替代染色劑。將溶液轉(zhuǎn)移到96孔板上，在波長(zhǎng)范圍560 ~ 650 nm內(nèi)測(cè)量吸收。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的光學(xué)評(píng)估顯示，試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品均為正常的成纖維細(xì)胞，如圖4所示。
圖4：用MTT染色的陰性對(duì)照樣品
所有測(cè)試樣品的細(xì)胞活性為85±7%
結(jié)合形態(tài)學(xué)的評(píng)估，Coral Life工作流清楚地顯示，SampLink室作為非常合適的實(shí)驗(yàn)工具，可以在任何活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將您感興趣的細(xì)胞保持在特定的生理狀態(tài)。