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蛋白純化技術是生物研究領域的一項重要技術。要研究某一個特殊蛋白質(zhì)，首先就要將這個蛋白從生物體中分離純化出來。蛋白純化方法主要是利用不同蛋白質(zhì)間的相似性與差異。依據(jù)蛋白間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì)，再根據(jù)蛋白質(zhì)的差異性將目的蛋白分離出來。

His-tag作為蛋白純化時的標簽，其優(yōu)勢在于：

1. N-端的His-Tag與細菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機制兼容，有利于蛋白表達；

2. 采用IMAC（固定化金屬離子親合層析）純化His-Tag融合蛋白操作更加簡便；

3. His-Tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學功能；

4. His-Tag非常小，在融合蛋白結晶后對蛋白的結構沒有影響；His-Tag的免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射入動物體內(nèi)進行免疫并制備抗體；

5. 與其它親和標簽構建成雙親和標簽，并可應用于多種表達系統(tǒng)；

His-Tag融合蛋白的適用范圍也較廣，既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進行純化。前者通常用來純化疏水性強的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白。

His-Tag親和層析填料

His-Tag可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，F(xiàn)e3+等，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的特性，使之被吸附在凝膠柱上，從而達到分離純化蛋白的目的。

Ni2+在親和純化實驗中的使用廣泛。根據(jù)結合基團的不同，Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六個螯合價位，其中Ni-IDA螯合了三價，Ni-NTA螯合了四價。所以IDA的載量要比NTA的高，在同樣條件下Ni-IDA洗脫時的咪唑濃度也高于Ni-NTA。但其弱的結合力使金屬離子在洗脫階段時很容易浸出，與目的蛋白緊密結合，從而導致分離蛋白產(chǎn)量偏低，產(chǎn)品不純及金屬離子污染等問題。而NTA的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落。

IMAC在通常的情況下是比較穩(wěn)定的，但螯合劑的存在則會導致其金屬離子脫落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑，如在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生了二羧酸類物質(zhì)。因此，E.coli在某些高壓情況下就會產(chǎn)生高特異性的金屬螯合劑（通常存在于細菌的細胞周質(zhì)中），導致His-Tag融合蛋白純化的純度和產(chǎn)量大大降低。所以在進行純化His-Tag融合蛋白的實驗時，首先需要去除螯合劑。

Ni-NTA親和層析實驗

Ni-NTA分離帶His標簽的重組蛋白

1. Ni-NTA裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；

2. 用緩沖液1平衡2~5個床體積，流速為2ml/min；

3. 將20ml細胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45um濾膜過濾，上樣，流速為1ml/min；

4. 用緩沖液1再洗2~5個床體積，流速為2ml/min；

5. 用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度；

6. 用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于低溫環(huán)境中保存。

緩沖液組成：

緩沖液1

50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄ 81ml，NaCl 29.3g，
加適量水溶解后定容到1000ml。

緩沖液2

50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加適量，水調(diào)pH后定容到1000ml。

緩沖液3

不同咪唑濃度的緩沖液B配制：

咪唑洗脫原理

Ni柱中的氯化鎳可以與有His-Tag的融合蛋白結合，也可以與咪唑進行結合，當標簽蛋白與層析柱表面珠孔內(nèi)的
鎳離子介質(zhì)發(fā)生結合時，不同濃度的咪唑通過層析柱，就會將與鎳配位的標簽蛋白，雜蛋白等分別洗脫下來，從而得到高純度目標蛋白。

附錄：Ni-IDA和Ni-NTA的一些參數(shù)對比