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在反興奮劑控制中使用 AssayMAP Bravo 樣品制備平臺進行半自動化 GC/Q-TOF 篩查
體育運動中的興奮劑是指對國際體育組織規(guī)定的禁用物質(zhì)和禁用方法的統(tǒng)稱。即除一般物質(zhì)外，也包括禁用方法和其它生理物質(zhì)，例如血液、尿液和含有違禁藥物成分的食品添加劑、營養(yǎng)補品、飲料等，只要這些生理物質(zhì)以“非正常量或通過不正常途徑”攝入人體，均被視為興奮劑。再比如用血液回輸以增強體內(nèi)紅細胞值的方法、尿液輸入膀胱以逃避檢測的方法，都屬于使用興奮劑。以及一些食品、飲品、補品中含有某種禁止使用且超出限制量的化學成分，也是興奮劑。
為了保持世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）的認證，各興奮劑檢測實驗室不斷努力提高分析方法的靈敏度、選擇性、重現(xiàn)性以及定量能力。不止如此，其對能夠隨時進行回顧性分析的可靠篩查方法的需求也在不斷增加[1]。
GC/MS 作為興奮劑檢測領(lǐng)域的一種重要工具，與 LC/MS 技術(shù)互補，可檢測尿樣中需進行篩查的約600種化合物中的400多種。
據(jù) WADA 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在過去幾十年中，AAS 一直是檢出最多的興奮劑之一（約占所有檢出物的 50%）。且在近幾年發(fā)現(xiàn)了幾種 AAS 的“長期代謝物”。這些代謝物需要耗費更長的時間排出體外，并且濃度往往低于傳統(tǒng)代謝物。硫酸化在這些長期代謝物的形成過程中起著重要作用，并且直到最近，LC/MS/MS 仍被認為是檢測 AAS 硫酸化代謝物的唯一技術(shù)。然而近期，已有全新研究證明，通過在熱進樣器中裂解硫酸基團，可以使用 GC/MS 檢測這些硫酸化代謝物[2,3]。與只能檢測硫酸基團丟失的 LC/MS/MS 相比，GC/MS 可以提供更高的分離能力和更多的結(jié)構(gòu)信息。
采用 GC/MS 方法的挑戰(zhàn)在于樣品前處理，可以使用乙酸乙酯液液萃取法（LLE）或固相萃取法（SPE）進行樣品前處理。SPE 具有更高的萃取回收率，以及相應(yīng)的沖洗程序，可以獲得更潔凈的提取物。此外，SPE 更適合自動化。基于多種需求，Agilent AssayMAP Bravo 系統(tǒng)已成為用于 SPE 自動化樣品前處理的強大平臺。AssayMAP Bravo 是一種微量色譜系統(tǒng)，可使用具有各種表面化學鍵合相的填充樹脂床小柱平行處理 1-96 個樣品。雖然 AssayMAP Bravo 系統(tǒng)通常被用作蛋白質(zhì)樣品前處理平臺，但本研究表明，與 LLE 方法相比，該系統(tǒng)不僅對硫酸化代謝物具有明顯更高的萃取回收率，對于其他幾乎所有極性化合物也同樣如此。借助小型化流程，減少了廢棄物，進而減少了對環(huán)境的影響。由此，我們提出了一種使用 GC/TQ、GC/Q-TOF 和 AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺的統(tǒng)一方法，幫助分析人員在興奮劑檢測應(yīng)用中實現(xiàn)高效篩查并獲得可靠結(jié)果。
圖 1. AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺
實驗部分
樣品
樣品包括使用去除類固醇的尿樣配制的 6 個校準品（繪制用于分析內(nèi)源性類固醇的校準曲線）、使用去除類固醇的尿樣配制的 4 種不同濃度水平的 4 個質(zhì)控（QC）樣品、1 個空白水樣、1 個陰性對照尿樣和 84 個真實尿樣。
水解
在 96 孔板中進行樣品前處理。向 0.5 mL 尿樣中加入氘代內(nèi)標（IS）混合物，并與大腸桿菌 β- 葡萄糖醛酸酶在 pH 7 的磷酸鹽緩沖液中于 56 °C 孵育至少 1 小時。
借助 AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺，使用自動化 SPE 進行樣品萃取
在 AssayMAP Bravo 上使用改良版的多肽凈化應(yīng)用程序，通過 Agilent AssayMAP 25 µL 反相（RP-S）小柱（貨號 G5496- 60023）進行自動化 SPE（圖 1）。使用 250 µL 甲醇，以 300 µL/min 的流速灌注 RPS 小柱，然后用 100 µL 20% 甲醇以 25 µL/min 的流速進行平衡。將 1 mL 樣品以 25 µL/min 的流速上樣至該小柱。然后用 250 µL 20% 甲醇以 25 µL/min 流速清洗該小柱。收集兩份連續(xù)洗脫液（第一份用 75 µL 甲醇以 7.5 µL/min 的流速洗脫，第二份用 75 µL 乙腈以 7.5 µL/min 的流速洗脫），并將其合并。
使用乙酸乙酯液液萃取法進行樣品萃取
按照“水解”一節(jié)所述進行水解，但使用帶螺口蓋的單獨玻璃管。將樣品在堿性條件（pH 9.5）下用乙酸乙酯萃取 20 分鐘，并收集有機層。將提取物在 40 °C 下氮吹至干，使用 50 µL MSTFA:NH4I:乙硫醇混合物在 80 °C 下衍生化 30 分鐘。
?數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理
采用兩套系統(tǒng)進行 GC/MS 分析，即 Agilent 7250 GC/Q-TOF 和 Agilent 7000C GC/TQ。創(chuàng)建含有 320 種 WADA 禁止的外源性化合物及其代謝物的精確質(zhì)量個人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫（PCDL），以便實施精確質(zhì)量 GC/Q-TOF 篩查方法。使用 Agilent MassHunter 定性分析軟件（10 版）將精確質(zhì)量 EI 碎片轉(zhuǎn)換為理論 m/z 值。然后使用 Agilent PCDL Manager 軟件（8.0 版）將譜圖導入精確質(zhì)量 PCDL 中。采用 MassHunter 定量分析軟件（10.2 版）進行進一步數(shù)據(jù)處理。
在興奮劑檢測領(lǐng)域使用 AssayMAP
Bravo 樣品前處理平臺的優(yōu)勢
與使用 AssayMAP Bravo 系統(tǒng)進行自動化樣品前處理相比，使用乙酸乙酯進行手動樣品萃取明顯更耗時，且效率更低。蒸發(fā) 5 mL 乙酸乙酯需要大約 45 分鐘，而對于 150 µL MeOH:ACN，則僅需要 10 分鐘。此外，LLE 涉及額外的樣品轉(zhuǎn)移步驟，需要 30 分鐘。自動化還可以顯著縮短手動操作時間，因為在樣品前處理過程中分析人員可以離開 AssayMAP Bravo，而采用手動方法時幾乎需要持續(xù)關(guān)注。使用自動化樣品前處理時，出錯的風險也顯著降低。另外，許多揮發(fā)性化合物（主要是興奮劑）會隨乙酸乙酯一起揮發(fā)，與自動化 SPE 相比，萃取回收率非常低。此外，加入衍生化試劑后的額外的樣品轉(zhuǎn)移步驟會導致回收率進一步降低。
使用 GC/Q-TOF 和 GC/TQ 儀器，對 LLE 程序（使用乙酸乙酯）與 AssayMAP Bravo 固相萃取方案的檢出限進行了比較，如圖 2 所示。對于非極性化合物（例如類固醇），使用 AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺時 LOD 的改善并不十分明顯，從僅降低百分之幾到降至原來的 1/4 不等。LOD 降至原來的 1/4 是由于 AssayMAP 萃取具有明顯更低的背景。對于極性較強的化合物（例如呋塞米，其最新 LOD 低于 0.4 ng/mL），AssayMAP Bravo 萃取方法的靈敏度是先前LLE萃取方法的 200倍以上，并能在最新 WADA MRPL 下實現(xiàn)檢測（圖 3）。
圖 2. 使用乙酸乙酯 LLE（左）和 AssayMAP Bravo（右）萃取時的 LOD 比較：（A）3-0H- 普羅斯它諾唑，利用 GC/TQ 進行分析；和（B）異美汀，利用 GC/Q-TOF 進行分析。每種萃取技術(shù)所對應(yīng)的 LOD 用紅圈標記
圖 3. 使用 AssayMAP Bravo 進行萃取時得到的呋塞米的 GC/Q-TOF LOD。LOD 用紅圈標記
參考文獻
1. Polet, M.; Van Gansbeke, W.; Van Eenoo, P. Development and Validation of an Open Screening Method for Doping Substances in Urine by Gas Chromatography Quadrupole Timeof-Flight Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 2018, 1042, 52–59. DOI: 10.1016/j.aca.2018.08.050
2. Balcells, G. et al. Detection and Characterization of Clostebol Sulfate Metabolites in Caucasian Population. J. Chromatogr. B. 2016, 1022, 54–63. DOI: 10.1016/j.jchromb.2016.03.028
3. Albertsdóttir, A. D. et al. Searching for New Long-Term Urinary Metabolites of Metenolone and Drostanolone Using Gas Chromatography–Mass Spectrometry with a Focus on NonHydrolysed Sulfates. Drug Test Anal. 2020, 12(8), 1041–1053. DOI: 10.1002/dta.2818