一、制備細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基
所使用的培養(yǎng)基將取決于所使用的細(xì)胞類型。例如:
使用無(wú)菌技術(shù)在II級(jí)安全帽下工作。
二、在顯微鏡下檢查細(xì)胞
在生長(zhǎng)過(guò)程中，應(yīng)該每天檢查細(xì)胞，以確保它們健康并按預(yù)期生長(zhǎng)。它們應(yīng)該主要附著在燒瓶的底部，形狀圓而豐滿或細(xì)長(zhǎng)，并在其膜周?chē)凵涔饩€。這表明他們是健康的。
介質(zhì)應(yīng)該是粉橙色。如果細(xì)胞大量分離和/或看起來(lái)干癟和顆粒狀/顏色深，則丟棄細(xì)胞，不要用于檢測(cè)。
三、制備細(xì)胞懸浮液
1. 所有細(xì)胞處理和培養(yǎng)基制備應(yīng)在II類安全柜中使用無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行。
2. 當(dāng)細(xì)胞融合70-80%時(shí)，它們?nèi)詰?yīng)處于生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)階段，可用于電鍍。
3. 首先將培養(yǎng)基在37°C水浴中加熱至少30分鐘。
4. 準(zhǔn)備好后，小心地從一個(gè)175平方厘米的培養(yǎng)皿中倒入所需細(xì)胞的培養(yǎng)基（含有實(shí)驗(yàn)室消毒劑），注意不要增加任何滴入的污染風(fēng)險(xiǎn)。
5. 立即更換，小心地倒入100毫升預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基。
6. 使用細(xì)胞刮板，輕輕刮掉燒瓶底部的細(xì)胞到培養(yǎng)基中。有些細(xì)胞系可能需要胰蛋白酶化。在繼續(xù)之前，檢查燒瓶底部，檢查所有的細(xì)胞是否脫落。
7. 確保待計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液通過(guò)輕搖瓶混合均勻。必要時(shí)可使用血清學(xué)移液管。
8. 在細(xì)胞wan全有機(jī)會(huì)沉淀之前，使用血清學(xué)移液管取出約1ml細(xì)胞懸液，并將其放置在附注管中。
9. 用血細(xì)胞計(jì)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
四、獲得正確的細(xì)胞密度
使用下面的計(jì)算得到正確的細(xì)胞密度。這應(yīng)該是4.5 × 105個(gè)細(xì)胞/mL左右，但需要根據(jù)細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。
N = df
45 × 104
N是每毫升細(xì)胞數(shù)
DF是計(jì)算出來(lái)的稀釋系數(shù)
由于細(xì)胞在100ml培養(yǎng)基中，接下來(lái)的計(jì)算是：
100 mL x稀釋因子
這將給出細(xì)胞應(yīng)該在的介質(zhì)體積的值。
用血清學(xué)移液管加入適量的預(yù)熱培養(yǎng)基。
例子:
如果細(xì)胞計(jì)數(shù)為55 × 104/mL，有100 mL細(xì)胞懸液：
55 × 104細(xì)胞/mL = 1.22
45 × 104細(xì)胞/mL
100毫升× 1.22 = 122毫升
因此，對(duì)于45 × 104/mL的細(xì)胞懸浮液，在100 mL細(xì)胞懸浮液中加入22 mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
如果正確細(xì)胞密度所需的體積小于100ml：
將細(xì)胞倒入50ml離心管中。
在離心機(jī)中以100轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)10分鐘，確保離心機(jī)平衡。
小心地倒出上清。
將細(xì)胞顆粒重懸于所需體積的預(yù)熱培養(yǎng)基中。
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