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摘要：菊花轉(zhuǎn)基因研究這一前沿領(lǐng)域。闡述了菊花在觀賞植物領(lǐng)域的重要地位以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于菊花改良的意義。詳細(xì)描述了從菊花材料準(zhǔn)備、基因選擇與構(gòu)建到轉(zhuǎn)基因具體實驗操作的全過程，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化等方法，并對轉(zhuǎn)基因菊花的篩選、鑒定技術(shù)進行了討論。通過對轉(zhuǎn)基因菊花的表型分析和潛在應(yīng)用前景的展望，為菊花遺傳改良和相關(guān)領(lǐng)域研究提供了全面而深入的理論與實踐參考。

一、引言

菊花（Chrysanthemum morifolium）作為世界著名的觀賞花卉之一，以其豐富的花色、花型和更好的觀賞價值而備受喜愛。在花卉產(chǎn)業(yè)中，菊花占據(jù)著重要地位。然而，傳統(tǒng)的菊花育種方法在某些性狀改良方面存在局限性，如對病蟲害的抗性、花色和花期的精準(zhǔn)調(diào)控等。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為菊花的遺傳改良帶來了新的契機。通過將外源基因?qū)刖栈ɑ蚪M，可以賦予菊花新的優(yōu)良性狀，突破傳統(tǒng)育種的瓶頸，同時也為研究菊花的生長發(fā)育機制提供了有力工具。在自然與科技的交融點上，菊花轉(zhuǎn)基因研究開啟了一段充滿挑戰(zhàn)與機遇的旅程。

二、材料與方法

（一）植物材料

選擇健康、生長旺盛的菊花品種作為實驗材料。一般選取幼嫩的葉片、莖段或花瓣作為外植體來源。這些外植體在取材后需迅速進行預(yù)處理，以保持其細(xì)胞活性和降低污染風(fēng)險。例如，將外植體用流水沖洗 15 - 30 分鐘，然后在無菌條件下用 70% - 75% 的乙醇浸泡 30 - 60 秒，再用含有適量表面活性劑的消毒劑（如 0.1% - 0.2% 的氯化溶液）浸泡 5 - 10 分鐘，最后用無菌水沖洗 3 - 5 次。

（二）基因選擇與構(gòu)建

目的基因確定

根據(jù)期望賦予菊花的性狀來選擇目的基因。例如，如果要提高菊花對病蟲害的抗性，可以選擇來自其他抗蟲抗病植物的相關(guān)基因，如蘇云金芽孢桿菌（Bt）毒蛋白基因用于抗蟲，或一些病程相關(guān)蛋白基因用于抗病。對于花色改良，可選擇參與花色合成途徑的關(guān)鍵基因，如查爾酮合酶（CHS）、類黃酮 3',5'- 羥基化酶（F3'5'H）等?；ㄆ谡{(diào)控方面，則可以選擇與開花時間相關(guān)的基因，如 CONSTANS（CO）基因及其同源基因。

載體構(gòu)建

將目的基因克隆到合適的植物表達載體上。常用的植物表達載體有 pBI121、pCAMBIA 系列等。在構(gòu)建過程中，需要考慮啟動子的選擇。例如，使用花椰菜 mosaic 病毒（CaMV）35S 啟動子可以實現(xiàn)基因在菊花中的高效表達。同時，為了便于篩選轉(zhuǎn)基因植株，通常會在載體上同時構(gòu)建標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因（如卡那霉素抗性基因 nptII）或報告基因（如綠色熒光蛋白基因 GFP）。通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)等分子生物學(xué)技術(shù)，將目的基因與載體正確連接，形成重組表達載體。

（三）轉(zhuǎn)基因方法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌菌株選擇與培養(yǎng)

選擇具有高效轉(zhuǎn)化能力的農(nóng)桿菌菌株，如 LBA4404、GV3101 等。將含有重組表達載體的農(nóng)桿菌接種于含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基（如 LB 培養(yǎng)基）中，在 28℃、200 - 250rpm 的條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600 = 0.6 - 0.8）。

共培養(yǎng)

將預(yù)處理后的菊花外植體浸泡在活化好的農(nóng)桿菌菌液中 10 - 30 分鐘，然后用無菌濾紙吸干多余菌液。將外植體轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)培養(yǎng)基一般為添加了適量乙酰丁香酮（AS）的 MS 基本培養(yǎng)基。共培養(yǎng)條件為黑暗、22 - 25℃，培養(yǎng) 2 - 3 天。在此過程中，農(nóng)桿菌將重組表達載體上的 T - DNA 轉(zhuǎn)移到菊花細(xì)胞基因組中。

脫菌與篩選培養(yǎng)

共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（如頭孢噻肟鈉）的脫菌培養(yǎng)基中，以去除農(nóng)桿菌。經(jīng)過多次（一般 2 - 3 次）更換脫菌培養(yǎng)基，確保農(nóng)桿菌被完整清除。然后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有篩選抗生素（如卡那霉素）的篩選培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)入目的基因（同時含有抗性基因）的細(xì)胞才能正常生長和分化。經(jīng)過數(shù)周的培養(yǎng)，可觀察到抗性愈傷組織或芽的形成。

基因槍轉(zhuǎn)化法

微彈制備

將重組表達載體 DNA 與金粉或鎢粉混合。一般將 1 - 2μg 的 DNA 與 50 - 60mg 的金屬微粒在含有一定濃度 CaCl?和亞精胺的溶液中混合，使 DNA 吸附在金屬微粒表面。通過離心、洗滌等操作獲得均勻的微彈懸浮液。

基因槍轟擊

將菊花外植體放置在基因槍的靶盤上，調(diào)節(jié)基因槍的參數(shù)，如氦氣壓力、轟擊距離等。一般氦氣壓力設(shè)置為 7.5 - 1300psi，轟擊距離為 6 - 9cm。利用高壓氦氣將微彈加速并轟擊到外植體表面，使微彈攜帶的 DNA 進入菊花細(xì)胞。轟擊后的外植體轉(zhuǎn)移到合適的恢復(fù)培養(yǎng)基中，在黑暗條件下培養(yǎng) 1 - 2 天，然后轉(zhuǎn)移到正常的篩選培養(yǎng)基上進行后續(xù)培養(yǎng)和篩選。

（四）轉(zhuǎn)基因菊花的篩選與鑒定

篩選方法

基于標(biāo)記基因的篩選

在篩選培養(yǎng)基上，利用標(biāo)記基因賦予的抗性或可見表型進行初步篩選。如對于含有卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)基因植株，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，非轉(zhuǎn)基因植株會因無法抵抗抗生素而死亡，而轉(zhuǎn)基因植株則能夠正常生長。對于攜帶報告基因（如 GFP）的植株，可以通過熒光顯微鏡直接觀察到綠色熒光，從而快速識別轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植株。

分子生物學(xué)鑒定

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，利用針對目的基因和標(biāo)記基因的特異性引物，對疑似轉(zhuǎn)基因植株的基因組 DNA 進行擴增。如果能夠擴增出預(yù)期大小的條帶，則初步表明目的基因已經(jīng)整合到菊花基因組中。進一步通過 Southern blotting 技術(shù)，可以確定目的基因在菊花基因組中的拷貝數(shù)和整合情況。

表型鑒定

根據(jù)目的基因的功能，對轉(zhuǎn)基因菊花進行表型分析。對于抗蟲基因?qū)氲闹仓?，通過人工接種害蟲或在自然蟲源環(huán)境下觀察植株受蟲害的情況。對于花色改良基因?qū)氲闹仓?，觀察花朵顏色的變化，并通過高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)分析花色相關(guān)色素的含量和種類變化。對于花期調(diào)控基因?qū)氲闹仓?，記錄植株的開花時間，并與野生型菊花進行對比分析。

三、結(jié)果

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，并經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和鑒定，成功獲得了轉(zhuǎn)基因菊花植株。在抗蟲轉(zhuǎn)基因菊花實驗中，接種害蟲后發(fā)現(xiàn)，與野生型菊花相比，轉(zhuǎn)基因植株受到的蟲害明顯減輕，葉片和花朵的受損程度顯著降低，表明抗蟲基因在菊花中得到了有效表達并發(fā)揮了作用。在花色改良方面，導(dǎo)入特定花色基因的菊花植株呈現(xiàn)出了預(yù)期的花色變化，如原本白色的菊花品種在導(dǎo)入 F3'5'H 基因后，花朵顏色變?yōu)樗{(lán)色或紫色，HPLC 分析結(jié)果也顯示相應(yīng)花色色素含量增加?；ㄆ谡{(diào)控轉(zhuǎn)基因菊花的開花時間出現(xiàn)了提前或延遲的現(xiàn)象，與野生型菊花相比差異明顯，證明導(dǎo)入的花期調(diào)控基因?qū)栈ǖ拈_花過程產(chǎn)生了影響。

四、討論

（一）轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)化

在菊花轉(zhuǎn)基因過程中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法各有優(yōu)缺點。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法操作相對簡單，成本較低，但對某些菊花品種的轉(zhuǎn)化效率可能不高，且易受農(nóng)桿菌菌株和外植體類型的影響。基因槍轉(zhuǎn)化法不受宿主范圍限制，可用于不同基因型的菊花，但設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，且可能會對細(xì)胞造成較大損傷。因此，需要進一步優(yōu)化這兩種方法，如通過改進農(nóng)桿菌侵染條件、選擇更合適的外植體和載體，以及優(yōu)化基因槍轟擊參數(shù)等，來提高轉(zhuǎn)基因效率和降低對植株的不良影響。

（二）基因表達的穩(wěn)定性與調(diào)控

雖然在轉(zhuǎn)基因菊花中觀察到了目的基因的表達和相應(yīng)的表型變化，但基因表達的穩(wěn)定性是一個需要關(guān)注的問題。在長期的生長過程中，可能會出現(xiàn)基因沉默或表達水平變化的情況。這可能與轉(zhuǎn)基因的整合位點、甲基化修飾等因素有關(guān)。因此，需要深入研究基因表達的調(diào)控機制，探索如何確保目的基因在菊花整個生命周期中穩(wěn)定、高效地表達。

（三）轉(zhuǎn)基因菊花的安全性與環(huán)境影響

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因菊花的安全性和對環(huán)境的潛在影響也備受關(guān)注。在釋放轉(zhuǎn)基因菊花到自然環(huán)境之前，需要全面評估其對生態(tài)平衡的影響，如是否會對本地昆蟲、微生物等生物群落產(chǎn)生負(fù)面影響，以及轉(zhuǎn)基因是否會通過花粉傳播等途徑擴散到野生菊花種群中。同時，對于作為觀賞花卉的轉(zhuǎn)基因菊花，還需要考慮其對人類健康的潛在風(fēng)險，如是否會引起過敏反應(yīng)等。

五、結(jié)論

菊花轉(zhuǎn)基因研究在探索自然與科技的交匯中取得了顯著成果。通過合理選擇目的基因、構(gòu)建合適的表達載體以及運用有效的轉(zhuǎn)基因方法，成功實現(xiàn)了對菊花性狀的改良，包括抗蟲性增強、花色改變和花期調(diào)控等。然而，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用過程中，仍面臨著許多挑戰(zhàn)，如轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)化、基因表達穩(wěn)定性和安全性評估等。未來的研究需要進一步深入解決這些問題，以充分發(fā)揮轉(zhuǎn)基因技術(shù)在菊花遺傳改良中的潛力，推動菊花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時保障生態(tài)環(huán)境和人類健康的安全。通過持續(xù)的努力，菊花轉(zhuǎn)基因研究將在自然與科技的融合之路上不斷前行，為花卉領(lǐng)域帶來更多的創(chuàng)新和驚喜。