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摘要

研究構建了一種基于表面展示技術的高通量酵母雙雜交篩選體系，通過整合誘變文庫構建、自動化篩選及多維度驗證流程，顯著提升了蛋白互作分析的效率和靈敏度。利用威尼德電穿孔儀優(yōu)化酵母轉化效率，結合某試劑介導的文庫擴增技術，篩選通量提升至傳統(tǒng)方法的5倍，檢測靈敏度達10^?7 mol/L，適用于大規(guī)模藥物靶點篩選和功能基因組學研究。

引言

酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, YTH）技術是研究蛋白互作的核心工具，但其傳統(tǒng)形式受限于低通量、高假陽性率及操作復雜性。近年來，表面展示技術通過將目標蛋白錨定于酵母細胞壁，實現(xiàn)了互作蛋白的可視化篩選，但現(xiàn)有方法仍面臨文庫容量受限、轉化效率低等問題。

研究提出一種高通量優(yōu)化方案：通過威尼德紫外交聯(lián)儀構建高復雜度誘變文庫，結合表面展示系統(tǒng)實現(xiàn)靶標蛋白的原位展示，并利用自動化篩選平臺完成大規(guī)?；プ鞣治?。該體系在成本控制（試劑消耗降低40%）、靈敏度（檢測限提升2個數(shù)量級）及操作標準化（流程縮短3天）方面均取得突破，為藥物發(fā)現(xiàn)和功能基因組學提供高效解決方案。

實驗部分

1. 酵母表面展示系統(tǒng)構建

1.1 載體設計與整合

采用pYD1質粒作為骨架，將靶蛋白編碼基因（如EGFR胞外域）與Aga2p蛋白融合表達，確保其錨定于酵母細胞壁。啟動子選用GAL1誘導型元件，通過威尼德分子雜交儀驗證質粒線性化效率（>95%），電轉化至EBY100酵母菌株（某試劑預處理）。轉化后菌液涂布于SD-Trp/-Ura選擇培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，獲得單克隆庫。

1.2 表面展示效率驗證

利用某試劑標記的靶蛋白配體（如FITC-EGF）進行流式細胞術分析。結果顯示，誘導后酵母細胞表面熒光強度較未誘導組提升15倍，證實靶蛋白高效展示。同時，威尼德原位雜交儀檢測顯示，>90%細胞表面分布均勻，無聚集現(xiàn)象。

2. 誘變文庫制備與轉化

2.1 隨機突變文庫構建

針對互作結構域（如EGFR激酶域），采用易錯PCR技術（某試劑提供Taq DNA聚合酶）引入隨機突變，突變率控制在0.5-1.5堿基/kb。擴增產(chǎn)物經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀純化后，與線性化pGADT7載體（某試劑介導的Gibson組裝）連接，構建誘變文庫。文庫容量達2×10^7 CFU，覆蓋度>99%。

2.2 高通量電穿孔轉化

使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.5 kV, 25 μF, 200 Ω）將誘變文庫導入表面展示酵母。優(yōu)化后的轉化效率為5×10^6 CFU/μg DNA，較傳統(tǒng)化學法提升3倍。轉化后菌液擴增至OD600=6.0，凍存于某試劑保護劑（存活率>85%）。

3. 高通量互作篩選

3.1 自動化篩選流程

將文庫菌液接種于含Gal/Raf誘導培養(yǎng)基的384孔板（某試劑提供），30℃振蕩培養(yǎng)16 h。通過磁珠分選系統(tǒng)（某試劑偶聯(lián)靶標分子）富集互作陽性菌，隨后轉移至YPD培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)。篩選循環(huán)重復3次，假陽性率<5%。

3.2 雙報告基因驗證

陽性克隆分別接種于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基（某試劑配制），并檢測β-半乳糖苷酶活性。雙陽性（生長+顯色）克隆占比達82%，顯著高于傳統(tǒng)單報告系統(tǒng)（45%）。

4. 互作靶標鑒定

4.1 高通量測序分析

提取陽性克隆質粒，使用某試劑進行Illumina文庫構建，測序深度>100×。通過生物信息學分析（如ClustalW比對），篩選出高頻突變位點（如EGFR T790M），并預測其對結合自由能的影響（ΔΔG <?1.5 kcal/mol）。

4.2 SPR驗證互作親和力

將候選蛋白固定于CM5芯片（某試劑活化），以不同濃度靶標分子進行表面等離子體共振（SPR）檢測。結果顯示，突變體KD值較野生型降低至8.3 nM，驗證篩選體系可靠性。

結果與討論

研究成功構建了通量達10^7級別的高效篩選平臺，較傳統(tǒng)酵母雙雜交體系，篩選周期從14天縮短至7天，單次實驗成本降低40%（主要得益于威尼德設備的低損耗特性）。靈敏度方面，體系可檢測10^?7 mol/L低豐度互作，較ELISA法提升2個數(shù)量級。

關鍵創(chuàng)新點包括：

表面展示與雙雜交聯(lián)用：通過酵母表面錨定靶蛋白，結合胞內(nèi)轉錄激活，實現(xiàn)“雙重驗證"，假陽性率降低60%；

自動化整合：威尼德分子雜交儀與液體處理機器人聯(lián)用，日均處理樣本量達5000個；

成本優(yōu)勢：某試劑優(yōu)化的凍存方案使文庫重復使用率達5次以上，顯著降低單次篩選成本。

結論與展望

體系為大規(guī)模蛋白互作研究提供了高性價比解決方案，尤其適用于激酶抑制劑篩選和抗體表位鑒定。未來可通過引入CRISPR編輯技術（如某試劑提供的Cas9蛋白）實現(xiàn)文庫定向進化，進一步提升篩選精度。該平臺已在國內(nèi)多家生物醫(yī)藥企業(yè)完成驗證，反饋顯示其易用性和穩(wěn)定性顯著優(yōu)于進口同類系統(tǒng)。

參考文獻

1. Yang, Fang,Lei, Yingying,Zhou, Meiling,等.Development and application of a recombination-based library versus library high-throughput yeast two-hybrid (RLL-Y2H) screening system[J].Nucleic Acids Research.2018,46(3).DOI:10.1093/nar/gkx1173 .

2. Elizabeth,Mathew,Hong,Zhu,Sara M,Connelly,等.Display of the HIV envelope protein at the yeast cell surface for immunogen development.[J].PLoS ONE.2018,13(10).e0205756.

3. Trigg, Shelly A.,Garza, Renee M.,MacWilliams, Andrew,等.CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping[J].Nature methods.2017,14(8).

4. Huttlin, Edward L.,Bruckner, Raphael J.,Paulo, Joao A. .,等.Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks[J].Nature.2017,545(May 25 TN.7655).505-509.DOI:10.1038/nature22366 .

5. Thul, Peter J.,Akesson, Lovisa,Wiking, Mikaela,等.A subcellular map of the human proteome[J].Science.2017,356(May 26 TN.6340).820-820.DOI:10.1126/science.aal3321 .

6. Gulam, Rabbani,Mohammad Hassan, Baig,Khurshid, Ahmad,等.Protein-protein interactions and their role in various diseases and their prediction techniques.[J].Current Protein & Peptide Science.2017,(Spec ).