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技術(shù)文章

生物分子類實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理匯總-5

閱讀:425          發(fā)布時(shí)間:2014-12-9

十一、BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度

十二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)制備

1、前夜接種受體菌(DH5?或DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)到第二日(約16小時(shí));

2、取1ml已培養(yǎng)到第二日的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)(250-300rpm);

3、將0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷;以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作;

4、吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;

5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘;

6、棄去上清,加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮,在冰放置20分鐘;

7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘;

8 、棄去上清,加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮;

9 、細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑(15% - 20%甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃)。

十三、堿變性提取質(zhì)粒DNA

堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離,當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí),變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型,保存在溶液中,而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過離心,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

十四、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選

(1)總過程:

分---PCR分離目的基因

切---限制性內(nèi)切酶切割

接---目的基因與載體相連

轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞

篩---篩選陽(yáng)性重組體

(2)分---PCR分離目的基因:PCR克隆、同源克隆、文庫(kù)篩選

(3)切---限制性內(nèi)切酶切割:粘性末端、平末端

(4)接---目的基因與載體相連

原 理:利用DNA聚合酶反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個(gè)或者幾個(gè)A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補(bǔ)配對(duì),經(jīng)連接酶作用,完成與載體的連接。

(5)轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞:經(jīng)過電擊、 CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,成為能容許外源 DNA 分子通過時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)。

(6)篩---篩選陽(yáng)性重組體

十五、RNA干擾(RNAi)

一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾(RNAi)。

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