化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
蛋白電泳：如何跑出漂亮的條帶 一
閱讀：1164 發(fā)布時(shí)間：2015-7-6
如果你能夠非常熟練的制備一塊的凝膠，甚至對(duì)它進(jìn)行改進(jìn)都十分困難，那么你真的應(yīng)該值得慶幸。但是如果你不能達(dá)到這個(gè)水平也不要灰心。
所有的的科學(xué)家都是從失敗中成長(zhǎng)起來(lái)的，事實(shí)上，如果不出錯(cuò)我們就很難學(xué)到更多的東西。
我們整理了 SDS-PAGE 「失誤大全」，包括了過(guò)去實(shí)驗(yàn)室中許多學(xué)生包括老師跑的zui「爛」的膠，它們代表了人們?cè)谂苣z是zui容易犯的多種錯(cuò)誤（當(dāng)然這些錯(cuò)誤仍在更新之中）。
看你自己的膠缺陷也許并不能很好的解決問(wèn)題，至少不是zui的解決方式，本文用圖例指出你可能在哪一些方面改進(jìn)你的技術(shù)。
評(píng)價(jià)你的膠找出你的癥狀并和本文收集的實(shí)例比對(duì)。每一個(gè)例子都配有完整的凝膠圖像和與之相對(duì)的解釋及建議。從這本「失誤大全」中你應(yīng)該能夠找到解決你的問(wèn)題的正確的方法。
我們將分期推出「失誤大全」的內(nèi)容，今天主要針對(duì)癥狀：涂抹痕跡（smears）
涂抹痕跡可能由于多種原因引起，但是zui常見(jiàn)的原因是聚丙烯酰胺凝膠倒膠的不均勻或者上樣量過(guò)大。
這塊膠倒膠不正確，在上部膠倒入制膠槽之前就已經(jīng)發(fā)生聚合。首先倒入的膠聚合發(fā)生的太快了。與其重新倒膠，不如停止倒膠重新準(zhǔn)備新的聚丙烯酰胺混合液，然后將新的膠倒入舊膠的上方。但是顯然這種連接不是非常牢固。
我推薦重新倒膠，制膠很關(guān)鍵，如果你后續(xù)還要做 blot，膠沒(méi)有跑好浪費(fèi)太多。
這塊膠每孔上樣量過(guò)大。大多數(shù)的泳道還是能分清條帶，但是在 3、4 道涂抹痕跡非常明顯。這些泳道的樣品主要含有一種蛋白（血紅蛋白的亞基），與 9、10 道一樣。
但是，3、4 道的樣品低估了紅細(xì)胞裂解物和紅細(xì)胞胞漿組分中的蛋白含量。這些組分包含了過(guò)多的蛋白以至于樣品需要稀釋后才能進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。但是這名學(xué)生卻忘記了這個(gè)樣品已經(jīng)稀釋過(guò)了，因此造成了蛋白濃度的低估。（嚴(yán)重的失誤）
小型膠每孔的蛋白樣品的量為20-40 微克，取決于所需的分辨率和混合液中包含的多肽數(shù)目。但是，如果是一個(gè)純化樣品上樣，一個(gè)帶包含了20-40 微克蛋白，那么其結(jié)果肯定也是一團(tuán)糟。
這也是一個(gè)上樣量過(guò)大的例子，這名學(xué)生似乎犯了和例 2 中同樣的錯(cuò)誤，因此在膠上也表現(xiàn)出各泳道的不一致性。
涂抹痕跡可能常見(jiàn)于用非連續(xù)膠跑膜相關(guān)蛋白這類脂質(zhì)含量豐富的樣品。在非連續(xù) PAGE 中，樣品蛋白基于兩個(gè)因素而被超濃縮。
首先，當(dāng)樣品從非限制性的積層膠移動(dòng)至限制速度的分離膠時(shí)遷移速率陡然下降。其次，也是zui重要的，pH 變化造成蛋白樣品電泳速率的改變，導(dǎo)致樣品突然停滯。一個(gè)高約半厘米左右的樣品被壓縮成為一個(gè)僅為數(shù)微米厚的薄層條帶，局部蛋白濃度急劇增加。
胞膜相關(guān)蛋白一般于較低濃度是沉淀，因此泳道的頂部通常有一條神色的條帶含有沉淀的蛋白。當(dāng)電泳進(jìn)行時(shí)沉淀的蛋白重新溶解然后持續(xù)進(jìn)入凝膠，因此造成了一個(gè)持續(xù)性的較深的不可分辨的背景。許多膜相關(guān)蛋白的凝膠圖像都顯示同樣的特征。
上圖中 4、7 道的蛋白樣品雖然含有相同的蛋白量，但是第 4 道的樣品中含有的膜蛋白的量超過(guò)了凝膠的分辨能力，造成了很深的涂抹痕跡。