高效色譜柱篩選
尿嘧啶和黃嘌呤，即咖啡因、可可堿和茶堿，是一組在各種生物過程和人類消費中起重要作用的有機化合物[1-3]。這些分子屬于雜環(huán)化合物，其特點是含有碳原子和氮原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。尿嘧啶是 RNA(核糖核酸)的基本組成部分，RNA 是形成遺傳密碼并參與蛋白質(zhì)合成的基本核堿基之一。另一方面，黃嘌呤、咖啡因、可可堿和茶堿是一類結(jié)構(gòu)相似但生物效應(yīng)不同的生物堿[1-3]。這些黃嘌呤存在于各種植物中，是一種眾所周知的興奮劑，可以穿過血腦屏障，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在 RP(反相色譜)[1-3]條件下(SN_802_2023)， LC(液相色譜)可分離生物堿。
超臨界流體色譜(SFC)是一種使用超臨界二氧化碳(CO2)作為流動相的基本成分的色譜技術(shù)。這種狀態(tài)的二氧化碳被稱為超臨界，它具有獨特的特性，如高擴散系數(shù)和低粘度，使其成為分離和分析化合物的絕佳溶劑。與傳統(tǒng)色譜方法相比，SFC 提供了許多優(yōu)勢，包括更快的分析時間，更低的溶劑消耗和分離的差異選擇性。此外，與 RP-LC 相比，SFC 代表了一種正交技術(shù)，為各種分析挑戰(zhàn)提供了互補的分離能力。
在 SFC 中，色譜柱篩選包括測試不同的固定相，以找到最適合特定分離任務(wù)的固定相。固定相是色譜系統(tǒng)的重要組成部分，因為它直接影響色譜的選擇性。不同的固定相具有不同的化學功能和與分析物的相互作用，使它們或多或少地選擇特定的化合物。通過篩選和選擇合適的色譜柱，可以優(yōu)化分離條件，以獲得更好的目標分析物的分辨率和靈敏度。
本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 儀器對尿嘧啶、咖啡因、可可堿和茶堿混合物進行平行柱篩選，隨后轉(zhuǎn)移到制備的 Sepiatec SFC-50。
設(shè)備
Sepiatec SFC-50 instrument
Sepmatix 8x SFC instrument
PrepPure Silica, 5μm, 250 x 10mm
PrepPure Diol, 5μm, 250 x 10mm
PrepPure Silica, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure Diol, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure Amino, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure 2-EP, 5μm, 250 x 4.6mm
Reprosil 4-EP, 5μm, 250 x 4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
PrepPure PEI, 5μm, 250 x 4.6mm
PrepPure CBD, 5μm, 250 x 4.6mm
Cyano, 5μm, 250 x 4.6mm, (Dr. Maisch GmbH)
試劑和材料
二氧化碳(99.9%)
甲醇(≥99%)
尿嘧啶(99% + %)
可可素(99%)
咖啡(99%以上)
茶堿(99%)
實驗
樣品制備：
在 50/2.5mL 甲醇/水混合液中，40℃ 下用超聲水浴溶解 0.05g 尿嘧啶，0.07g 咖啡因，0.055g 可可堿，0.085g 茶堿。
Sepmatix 8x SFC 篩選運行條件：
流動相：A =二氧化碳：甲醇
流速：3ml /min(每柱)
流動相條件：
0-0.5min：5% B
0.5-8.0min：5 - 50%
8.0-9.4min：50%
9.4-9.5min：50 - 5%
9.5-10min：5% B
檢測：紫外掃描波段：200nm - 600nm
篩選運行是自動開始的。使用流量控制單元將流量設(shè)置為每通道 3mL/min，并平衡色譜柱。自動進樣(V=5 μL)，開始平行篩選(運行時間=10min)。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar，柱箱加熱至 32°C。
SFC-50 運行條件：
流動相：A =二氧化碳；B=甲醇
流動相條件：等度運行條件
檢測：紫外波長 270nm
SFC 柱在規(guī)定的流速下條件預熱 3 分鐘，使用定量環(huán)自動注入樣品并開始運行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar，柱箱加熱至 40°C。
結(jié)果與討論
用 Sepmatix 8x SFC 篩選色譜柱：
為了確定樣品的最佳分離選擇性，進行了不同色譜柱的篩選。使用 Sepmatix 8x SFC 儀器可以高效地同時篩選8個色譜柱。因此，最佳選擇性可以在很短的時間內(nèi)確定。為此，使用了 8 種不同的固定相:硅膠、二醇基、氨基、氰基、2-EP、4-EP、PEI 和 CBD，圖1顯示了篩選的結(jié)果。
▲圖1：Sepmatix 8x SFC 儀器篩選結(jié)果。從左到右依次為:硅膠、氨基、氰基、二醇基；下從左至右依次為：2-EP、4-EP、PEI、CBD 柱；運行時間=10分鐘
用分辨率(R)來衡量色譜方法在色譜圖中分離和區(qū)分兩個相鄰峰的能力，它量化了分析物相互分離的程度。表 1 顯示了 4 組分分離的分辨率值。使用 Sepmatix 軟件和以下公式自動確定：
其中tR1 和 tR2 代表 組分 1 或組分 2 的保留時間
W1 和W2 代表分量1或分量 2 峰高一半處的寬度
在處理復雜的混合物時，分辨率尤其重要，因為它確保每個分析物都被很好地分離，并且可以準確地識別和定量。分辨率為 1 表示峰值根本沒有被分解，基本上是合并的，而更高的分辨率值表示峰值之間的分離更好。在使用過程中，分辨率至少應(yīng)達到 1.5，才能以適當?shù)亩亢丸b定分析物。
色譜柱 | R1 | R2 | R3 |
硅膠 | 1.57 | 4.18 | 3.79 |
氨基 | 5.42 | 1.26 | 4.44 |
氰基 | 未分離 | 3.35 | 1.69 |
二醇 | 3.92 | 5.1 | 2.29 |
2-EP | 3.62 | 2.72 | 未分離 |
4-EP | 9.46 | 2.87 | 未分離 |
PEI | 9.93 | 1.86 | 10.8 |
CBD | 5.01 | 1.27 | 4.51 |
表1：SFC 不同篩選條件下的分辨率值
R 值的篩選和評價表明，硅膠、二醇基和 PEI 相對樣品的分離選擇性最好。二醇基在運行時間和分辨率方面表現(xiàn)出最佳性能。硅膠柱上的分離并不完全是茶堿和咖啡因的基線分離。PEI 相的運行時間相對較長，因為樣品分子的位阻較大。表 2 為洗脫順序，這是通過測定的光譜和組分的單獨進樣來確定的。與其他相相比，硅膠顯示出不同的洗脫順序。對于氰基、2-EP 和 4-EP，不能完全確定洗脫順序。
色譜柱 | 洗脫順序 | ||
硅膠 | 茶堿，咖啡因，尿嘧啶，可可堿 | ||
氨基 | 咖啡因，茶堿，可可堿，尿嘧啶 | ||
氰基 | 咖啡因和茶堿的雙峰，可可堿，尿嘧啶 | ||
二醇 | 咖啡因，茶堿，可可堿，尿嘧啶 | ||
2-EP | 咖啡因，茶堿，可可堿和尿嘧啶的雙峰 | ||
4-EP | 咖啡因，茶堿，可可堿和尿嘧啶的雙峰 | ||
PEI | 咖啡因，茶堿，可可堿，尿嘧啶 | ||
CBD | 咖啡因，茶堿，可可堿，尿嘧啶 | ||
表2：SFC 不同色譜柱篩選條件下的洗脫順序
將開發(fā)方法通過 SFC-50 放大：
由于二醇基取得了最好的結(jié)果，因此選擇了 5μm, 250 x 10mm 的 PrepPure 二醇基進行 Sepiatec SFC-50 方法放大制備。由于通過堆疊注射法純化混合物的效率明顯高于多次梯度注射法，該方法是在等度運行條件下實施的，這是使用堆疊進樣的要求。在等度條件下，樣品只能在低甲醇含量下分離(見圖2，下)。在高甲醇濃度下，由于流動相的高洗脫強度，尿嘧啶、咖啡因、茶堿和茶堿是不可分離的(見圖2，上)。
▲圖2：使用 PrepPure Diol 5 μm, 250 x 10mm 色譜柱分離樣品。上:流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃，270nm, 33% B，進樣量= 0.09 mL，運行時間= 4 min；下:流量= 20 mL/min 150 bar 40°C, 270 nm, 12%甲醇，0.09 mL，運行時間= 5 min
改變壓力和溫度可以優(yōu)化分辨率。最佳分離條件為 40℃ 和 150bar。
圖 3 為圖 2(下)實驗條件下的堆疊進樣情況，堆疊時間為 2.42min，因此每 2.42min 進樣一次。在這種情況下，由于每次額外注入節(jié)省了平衡時間，因此提高了產(chǎn)能。
為了更有效的多次分離，可以使用硅膠填料。使用 34% 的甲醇作為改性劑，將堆疊時間縮短至 2.15min。與二醇基相比，硅膠填料在 100bar 下表現(xiàn)出更好的性能。然而，在 1.5 的分辨率下，咖啡因和茶堿并不能獲得理想的基線分離。由于硅膠的極性比二元醇高，為了快速洗脫，必須增加改性劑的含量，但這也導致溶劑消耗增加。
結(jié)論
在本文中，使用 Sepmatix 8x SFC 進行柱篩選，并將開發(fā)結(jié)果轉(zhuǎn)移到 Sepiatec SFC-50 進行放大。在色譜參數(shù)分辨率和運行時間方面，二醇基表現(xiàn)出最好的效果。對于二醇基，根據(jù)篩選結(jié)果，在 Sepiatec SFC-50 儀器上采用 250 × 10 mm 柱進行等度堆疊進樣。作為比較，開發(fā)了另一種用于硅膠填料的方法，但分辨率值略差。
這種分離表明，要想在 prep-SFC 中獲得一個好的分離方法，事先通過柱篩選確定最佳選擇性是很重要的。然后，該方法可以在 prep-SFC 上簡單實現(xiàn)，并進行了優(yōu)化。最理想的是，該方法在等度條件下應(yīng)用，以最大限度地提高產(chǎn)量。
每次注射后的疊加紫外信號表明該方法具有良好的再現(xiàn)性(圖3和4，下面)。垂直線描述了收集相應(yīng)分數(shù)的時間窗口。
▲圖3：堆疊進樣與二醇柱分離。流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃，270 nm, 12% B，進樣量= 0.12 mL；堆疊時間:2.42 min，注射次數(shù)：8次；上圖：最終色譜圖；下圖為各注射劑的紫外信號疊加圖
▲圖4：堆疊進樣與硅膠柱分離。流速= 16 mL/min, 100 bar, 40℃，270 nm, 34% B，進樣量= 0.09 mL；堆疊時間:2.15 min，注射次數(shù)：7次；上圖：最終色譜圖；下圖：分別在254 nm和270 nm處注射的疊加紫外信號
參考文獻
https://doi.org/10.1093/chromsci/46.2.144
DOI: 10.1021/jf030817m
DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.11.013
DOI: 10.1016/j.saa.2004.03.030
Laboratory Chromatography Gμide, ISBN 3-033-00339-7, by Büchi Labortechnik AG (Switzerland)
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