利用步琦SFC系統(tǒng)純化
阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因
SFC應(yīng)用
”
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簡(jiǎn)介
化學(xué)合成常伴有雜質(zhì)，因產(chǎn)率很少達(dá) 100%，雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響藥物療效、安全和質(zhì)量，所以純化藥物保障其純度和完整性至關(guān)重要，在現(xiàn)代藥物研發(fā)的過程中往往通過色譜法等多種方法純化。
在上一篇應(yīng)用文章《利用步琦 SFC 系統(tǒng)純化利多卡因與乙酰氨基酚》中，我們使用超臨界流體色譜（SFC）高效純化了利多卡因和乙酰氨基酚的合成產(chǎn)物。在此過程中，我們先使用步琦 Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)快速篩選了色譜柱，之后將其放大到 BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)上。本次應(yīng)用中，我們依舊會(huì)使用同樣的工作流程去純化阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因的合成產(chǎn)物。
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實(shí)驗(yàn)設(shè)備
BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
BUCHI PrepPure 硅膠，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm
HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm
氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×10mm
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化學(xué)品與樣品
化學(xué)品：
二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中 2M 的氨溶液
甲酸（99%）
去離子水
為了安全處理，請(qǐng)注意所有相應(yīng)的MSDS！
樣品：
普魯卡因合成產(chǎn)物
阿司匹林合成產(chǎn)物
苯佐卡因合成產(chǎn)物
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程序設(shè)定
BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜柱系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色譜柱）
檢測(cè)：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm
流動(dòng)相條件：
0 – 0.5 min | 5 % B | |
0.5 – 8.0 min | 5 – 50 % B | |
8.0 – 9.4 min | 50 % B | |
9.4 – 9.5 min | 50 – 5 % B | |
9.5 – 10 min | 5 % B | |
篩選運(yùn)行全自動(dòng)運(yùn)行，流速設(shè)置為 3mL/min 每通道，使用流控單元，平衡每一根色譜柱。樣品自動(dòng)注入（V=5μL），并開始平行篩選（運(yùn)行時(shí)間=10min）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 32℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流動(dòng)相條件：等度運(yùn)行條件
檢測(cè)：紫外
所有 10mm ID 色譜柱都在預(yù)設(shè)流速下平衡 3 分鐘，使用自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，并開始運(yùn)行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 40℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
5
結(jié)果
5.1 阿司匹林
阿司匹林，化學(xué)名為乙酰水楊酸（下稱 ASA），是一種鎮(zhèn)痛和抗炎藥物。它屬于非甾體抗炎藥（NSAIDs）這一類。可以通過將水楊酸（下稱 SA）與乙酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)而化學(xué)合成（見圖5） [1] 。為了確定乙酰水楊酸的理想分離選擇性，首先進(jìn)行了色譜柱柱篩選（見圖1）。
▲ 圖 1：頂部：阿司匹林合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘。
由于 SA 在固定相中的保留性較高，為了強(qiáng)制洗脫 SA，在梯度中增加了一個(gè)等度步驟，即在 50% 改性劑濃度下進(jìn)行 5 分鐘的等度洗脫。在 HILIC 相中，ASA 和 SA 只有噪音而無洗脫。在 PEI 相中，在實(shí)驗(yàn)條件下只有 ASA 被洗脫。除氰基相外，其余各相均顯示出 ASA 和 SA 的分離。結(jié)合分離時(shí)長(zhǎng)和分辨率而言，2-EP 相的結(jié)果最好（見表 1）
▲ 表1：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
選擇 2-EP 相作為固定相，放大至制備規(guī)模。在色譜柱篩選的過程中，ASA 和 SA 在 2-EP上被洗脫的甲醇比例為 26 - 40%。圖 2（上）顯示了在甲醇比例為 40% 的10x250mm 2-EP 色譜柱上純化 ASA 和 SA 的情況。改性劑中添加了甲酸（0.5%），以改善 SA 的峰形。在不添加甲酸的情況下，SA 的拖尾非常嚴(yán)重。在相同條件下，可采用疊加進(jìn)樣法自動(dòng)純化 ASA（見圖2下），并進(jìn)行餾分收集。
▲ 圖 2：ASA 純化的單次進(jìn)樣（上圖）和疊加進(jìn)樣（下圖）；運(yùn)行條件：流速 = 30 mL/min，改性劑 = 甲醇 + 0.5 % 甲酸，改性劑 % = 40 %，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，進(jìn)樣量 = 200 μL，紫外波長(zhǎng) = 254 nm；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 10，疊加時(shí)間 = 2.0 min，餾分 = 1（基于時(shí)間）。
5.2 苯佐卡因
苯佐卡因（下稱 BC），化學(xué)名為對(duì)氨基苯甲酸乙酯，屬于局部麻醉劑類。它可以從對(duì)氨基苯甲酸（下稱 PABA）通過酸催化羧基與乙醇的酯化反應(yīng)化學(xué)合成，用硫酸作為催化劑 [2]。首先進(jìn)行色譜柱篩選，以確定苯佐卡因合成產(chǎn)物理想的分離選擇性（見 圖3）。
▲ 圖3：頂部：苯佐卡因合成反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 15分鐘。
由于 PABA 在固定相中的保留性較強(qiáng)，因此在梯度中增加了一個(gè)等度步驟，在 50% 甲醇的條件下運(yùn)行 5 分鐘，硫酸通過洗滌步驟去除避免過高的酸性。各固定相的色譜圖顯示，每種固定相都能分離苯佐卡因，但是洗脫速度和分辨率存在很大差異（見表2）。HILIC 和氨基相的分辨率最高，但 PABA 的保留時(shí)間過長(zhǎng)，即使用50%的甲醇洗脫，依舊需要很長(zhǎng)時(shí)間。
▲ 表2：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序。
結(jié)合柱篩選結(jié)果，最終選擇二醇基相作為制備色譜柱。HILIC 和氨基相需要較高比例的甲醇和較長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間。二醇基相不僅可以非?？焖俚叵疵摌悠?，并具有足夠高的分辨率。二醇基柱的篩選結(jié)果表明，BC 和 PABA 在甲醇比例為 30 - 40% 時(shí)即可洗脫。
圖 4（上圖）顯示了 10 x 250mm 的二醇基色譜柱在甲醇比例為 28% 時(shí)對(duì)苯佐卡因的純化情況。在相同條件下，可采用疊加進(jìn)樣法自動(dòng)純化 BC（見圖4下），并進(jìn)行餾分收集。
▲ 圖 4：苯佐卡因的單次注射（頂部）和堆疊注射（底部）純化；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min， 改性劑 = 甲醇，改性劑 % = 28%，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，注射量 = 90 μL，UV 波長(zhǎng) =276nm；堆疊注射條件：注射次數(shù) =12，堆疊時(shí)間 =0.66min，餾分 =1（基于時(shí)間的）。
5.3 普魯卡因
普魯卡因（下稱 PC），化學(xué)名為 4-氨基苯甲酸 2-(N, N-二乙基氨基)乙酯，是一種藥物，具有局部麻醉作用。它阻斷電壓依賴性鈉離子通道，從而導(dǎo)致例如疼痛敏感性的降低。普魯卡因可以通過化學(xué)方法在堿性條件下從 4-氨基苯甲酸乙酯（下稱ABE）合成。這涉及到使用 2-二乙基氨基乙醇進(jìn)行酯交換[3]。堿是乙醇鈉醇，它可以通過鈉與乙醇的反應(yīng)產(chǎn)生。為確定普魯卡因合成產(chǎn)物純化的理想選擇性，進(jìn)行了色譜柱篩選（見圖 5）。
▲ 圖5：頂部：普魯卡因合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 15分鐘。
由于普魯卡因在固定相中的保留性較高，因此在梯度中增加了一個(gè)等度步驟，即在 50% 甲醇濃度下進(jìn)行 5 分鐘的梯度。結(jié)果顯示，每種固定相對(duì)普魯卡因的純化都有合適的選擇性（見表3）。普魯卡因在硅膠、PEI 和氰基固定相中的保留性較高。
由于普魯卡因的基本特性，在部分色譜柱上的峰形非常不對(duì)稱。二醇基相下的峰前沿非常明顯，不對(duì)稱度系數(shù)為 0.58，而硅膠相下的拖尾非常明顯，不對(duì)稱度系數(shù)為 2.73。
▲ 表3：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序。
結(jié)合柱篩選結(jié)果，選擇 2-EP 相放大為制備純化的方法。硅膠相需要高含量的甲醇才能洗脫出 PC，導(dǎo)致運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，峰形不佳。而 2-EP 相既可以快速洗脫樣品，又具有足夠高的分辨率。為了改善峰型，在甲醇改性劑中加入 5 % 的去離子水和 20 mM 的氨水作為添加劑。
篩選結(jié)果表明，PC 和 ABE 在改性劑含量約為 24 - 32% 時(shí)可以從色譜柱內(nèi)洗脫下來。圖6（上圖）顯示了10 x 250mm 的 2-EP 色譜柱在改性劑含量為 25% 時(shí)純化 PC 的情況。在相同條件下，可采用疊加進(jìn)樣法自動(dòng)純化 PC（見圖6，下圖）并收集餾分，添加添加劑可顯著改善 PC 的峰形。
▲ 圖 6：普魯卡因純化的單次進(jìn)樣（上圖）和疊加進(jìn)樣（下圖）；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min，改性劑 = 甲醇/水（95/5 %）加 20 mM 氨水，改性劑 % = 25 %，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，進(jìn)樣量 = 100 μL，紫外波長(zhǎng) = 220 nm；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 10，疊加時(shí)間 = 1.1min，餾分 = 2（基于時(shí)間）。
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結(jié)論
超臨界制備色譜純化合成產(chǎn)物高效快速，但需篩選合適的色譜填料。BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)可快速篩選填料并放大至制備規(guī)格，既能提高樣品分離度，又能充分利用色譜柱上樣量，為 BUCHI Sepiatec SFC-50 制備系統(tǒng)的疊加進(jìn)樣奠定良好基礎(chǔ)，二者結(jié)合可達(dá)到降本增效的目的。
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參考文獻(xiàn)
Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).
Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-präparativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).
Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).
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