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Polysciences 24765-1轉(zhuǎn)染試劑——用于貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染流程

閱讀:129      發(fā)布時(shí)間:2025-3-10
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操作方法: 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞為例
(初次使用 PEI 進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)先做預(yù)試,優(yōu)化出適合自己實(shí)驗(yàn)的最 佳 PEI DNA 的比例。)

轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備:

1. 轉(zhuǎn)染前一天:用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(不建議用胰酶)。按照每孔2x106的細(xì)胞量接種 293T6孔板(每孔加入2ml新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養(yǎng)基和1ml的細(xì)胞懸液)置于 37°C,5%C02,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h

2. 24h后,移除之前培養(yǎng)基,每孔加入2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意:確保 293T 細(xì)胞生長狀態(tài)良好傳代不超過 15 代。

轉(zhuǎn)染流程:
1. 第一天: 顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70%80%的匯合度時(shí),開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
2. 對(duì)于每孔細(xì)胞,用 100μL無血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEMI培養(yǎng)基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃度為 1ug/mlDNA/總培養(yǎng)體積)。

3. 對(duì)于每孔細(xì)胞,用 100μL無血清培養(yǎng)基(OPTI-MEM I培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的適量24765-1。DNA:PEI的比例要依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)摸索最適比例。
4. 將稀釋的 24765-1轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中(總體積 200μL)輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。

4. 小心地將 PEI-DNA 復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。注意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入,而不是在細(xì)胞的頂部以免破壞細(xì)胞的粘附性。
6. 將培養(yǎng)板放入 37°C,5%C02,培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。

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觀察結(jié)果:
第二天,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,通常超過 80%293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的 24h可以觀察到綠色熒光。

注意:
 建議進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)對(duì) PEI DNA 的比例進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到最適比例,通常 篩選范圍在 1:1 5:1 之間。

通常情況下,分別準(zhǔn)備 PEI DNA 轉(zhuǎn)染溶液時(shí)其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細(xì)胞培養(yǎng)液 體積總量的 1/10-1/20,如細(xì)胞培養(yǎng)液體積為 3ml,則稀釋 PEI DNA 的體積為 150ul 。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/mlDNA 質(zhì)量/細(xì)胞培養(yǎng)總體積)。

不同質(zhì)粒種類以及大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,如較大片段插入質(zhì)??赡苻D(zhuǎn)染效率低,可根據(jù) 實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整,如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)??偭康?。

 HEK293 GnTI 細(xì)胞重懸浮可用槍頭或移液管反復(fù)吹打,但 CHO-S 細(xì)胞的粘附性比較強(qiáng),重懸浮時(shí)需要借助細(xì)胞刮刀。

一般建議用膠原酶消化細(xì)胞,如果表達(dá)的是膜蛋白,胰酶消化細(xì)胞可能會(huì)降低蛋白表達(dá), 建議用膠原酶消化細(xì)胞。
對(duì)于貼壁性低的細(xì)胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。

 一旦確定了細(xì)胞類型、培養(yǎng)基和 PEI DNA 的最佳比例,就可以在轉(zhuǎn)染后 24 96 小時(shí)內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率,以優(yōu)化最大表達(dá)量時(shí)間點(diǎn)。

 

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現(xiàn)貨供應(yīng):公司庫存充足,可快速發(fā)貨,減少用戶等待時(shí)間。

效期保障:嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量,確保試劑效期新鮮,保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

專業(yè)技術(shù)支持:提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo),幫助用戶優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,提高實(shí)驗(yàn)成功率。

定制化服務(wù):根據(jù)用戶需求,提供個(gè)性化的產(chǎn)品和服務(wù)解決方案。

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