凝膠色譜儀（GPC/GFC）是蛋白質(zhì)純度分析與聚集體檢測的核心工具，其核心原理基于分子篩效應(yīng)：大分子因無法進(jìn)入凝膠孔隙而快速流出，小分子則因深入孔隙而延遲洗脫，從而實現(xiàn)分子量依賴的分離。以下是具體解析方法：
一、蛋白純度分析
分離機(jī)制
使用葡聚糖（Sephadex）或瓊脂糖（Sepharose）填料構(gòu)建凝膠柱，流動相為低離子強(qiáng)度緩沖液（如PBS）。
目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白、核酸）因分子量差異被分離，純蛋白在單一峰中洗脫，雜質(zhì)形成肩峰或拖尾。
純度評估
峰面積積分：通過紫外檢測器（UV280nm）計算目標(biāo)蛋白峰面積占比，純度=目標(biāo)峰面積/總面積×100%。
標(biāo)準(zhǔn)品對比：與已知純度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（如BSA）共跑，對比保留時間與峰形一致性。
二、聚集體檢測
聚集體形成機(jī)制
蛋白質(zhì)在儲存、運(yùn)輸或高溫條件下易發(fā)生二硫鍵交換、疏水相互作用，形成二聚體、寡聚體甚至可溶性聚集體。
檢測方法
多角度光散射（MALS）聯(lián)用：實時監(jiān)測分子量變化，聚集體表現(xiàn)為保留時間提前且分子量顯著增大（如單體50kDavs二聚體100kDa）。
峰形分析：聚集體導(dǎo)致峰形不對稱（前延或拖尾），通過第二維分析（如SEC-MALS）可定量聚集體比例。
案例
某單抗藥物在40℃儲存后，凝膠色譜圖顯示主峰前出現(xiàn)肩峰，MALS檢測到20%二聚體，證實高溫導(dǎo)致聚集。
三、技術(shù)優(yōu)化
柱效提升：使用小粒徑填料（如3μm）提高分辨率，縮短分析時間至15分鐘。
溶劑兼容性：選擇pH耐受范圍廣的凝膠（如Superdex200Increase），避免蛋白變性。
自動化：結(jié)合液相色譜系統(tǒng)（如AKTA），實現(xiàn)梯度洗脫與在線濃度監(jiān)測。
凝膠色譜儀通過分子量依賴的分離機(jī)制，可直觀解析蛋白純度與聚集體水平，為生物制藥質(zhì)量控制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。
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