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落射熒光顯微鏡的工作原理和使用細(xì)節(jié)

閱讀:345      發(fā)布時(shí)間:2025-1-20
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  落射熒光顯微鏡是一種在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的光學(xué)儀器,其工作原理基于物質(zhì)受激發(fā)光照射后產(chǎn)生熒光的特性。以下是關(guān)于落射熒光顯微鏡的工作原理和使用細(xì)節(jié)的描述:
  工作原理
  1. 光源:落射熒光顯微鏡通常使用高壓汞燈或氙燈等高強(qiáng)度光源,這些光源能夠發(fā)出特定波長(zhǎng)范圍的光,包括紫外線、可見(jiàn)光等。
  2. 激發(fā)濾光片:從光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)激發(fā)濾光片,該濾光片允許特定波長(zhǎng)范圍的光通過(guò),以激發(fā)樣品中的熒光分子。常見(jiàn)的激發(fā)濾光片有B(藍(lán)光)、G(綠光)和UV(紫外光)等,分別用于不同熒光染料的激發(fā)。
  3. 物鏡和聚光器:通過(guò)物鏡和聚光器的作用,將激發(fā)光聚焦到樣品上。物鏡不僅起到放大作用,還直接作為聚光器,將光線垂直照射到標(biāo)本上,使樣品受到激發(fā)。
  4. 分色鏡:分色鏡位于激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片之間,以45°角放置。它的作用是將激發(fā)信號(hào)反射到熒光團(tuán),并將發(fā)射信號(hào)傳輸?shù)綑z測(cè)器。
  5. 發(fā)射濾光片:樣品被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光經(jīng)過(guò)發(fā)射濾光片,該濾光片只允許特定波長(zhǎng)范圍的熒光通過(guò),以過(guò)濾掉其他波長(zhǎng)的光,從而獲得清晰的熒光圖像。
  6. 目鏡或檢測(cè)器:最后,熒光通過(guò)目鏡或檢測(cè)器進(jìn)行觀察或記錄?,F(xiàn)代落射熒光顯微鏡通常配備有高分辨率的CCD相機(jī),可以捕捉并記錄熒光圖像,便于后續(xù)分析和處理。
  使用細(xì)節(jié)
  1. 樣品制備:在使用落射熒光顯微鏡前,需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹苽洹?duì)于生物樣品,通常需要進(jìn)行固定、染色等處理,以提高熒光信號(hào)的強(qiáng)度和特異性。染色時(shí)需選擇合適的熒光染料,并根據(jù)染料的特性調(diào)整激發(fā)光和發(fā)射濾光片的組合。
  2. 開(kāi)機(jī)準(zhǔn)備:打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),啟動(dòng)汞燈或其他光源,并等待光源穩(wěn)定。同時(shí),根據(jù)需要選擇相應(yīng)的激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片組合。
  3. 放置樣品:將制備好的樣品放置在載物臺(tái)上,并調(diào)整焦距以獲得清晰的圖像。如果需要觀察活細(xì)胞或動(dòng)態(tài)過(guò)程,可以將樣品放置在培養(yǎng)皿或載玻片上,并通過(guò)顯微鏡觀察其變化。
  4. 觀察與記錄:通過(guò)目鏡或連接的計(jì)算機(jī)顯示器觀察熒光圖像,并可以使用顯微鏡工業(yè)相機(jī)等設(shè)備對(duì)圖像進(jìn)行拍攝和記錄。在觀察過(guò)程中,可以根據(jù)需要調(diào)整放大倍數(shù)、焦距和光照強(qiáng)度等參數(shù),以獲得最佳的圖像效果。
  5. 關(guān)機(jī)清理:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,關(guān)閉電源開(kāi)關(guān),并清理顯微鏡和樣品。定期對(duì)顯微鏡進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng),以確保其性能和精度。

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